ИСТИНА

НИР посвящена исследованию молекулярных механизмов зрения.

1. Проведено сравнительное исследование сверхбыстрых прямой и обратной фотореакций двух ретиналь-содержащих белков – зрительного (фоторецепция) и бактериального (бактериородопсин, фотосинтез) родопсинов, проведённое при помощи уникальной фемтосекундной трёхимпульсной лазерной установки с двумя возбуждающими и третьим зондирующим импульсами. Показано, что эффективность обратной фотохромной реакции природного бактериородопсина в пять раз выше по сравнению со зрительным родопсином (0.81 и 0.16, соответственно). Предполагается, что в зрительном родопсине механизм взаимодействия хромофора (11-цис ретиналя) с ближайшим белковым окружением в хромофорном центре опсина становится в ходе эволюции более совершенным, обеспечивая большую эффективность прямой фотохимической реакции изомеризации 11-цис ретиналя, запускающей процесс фототрансдукции. Проведено сравнительное исследование фотохромных реакций природного и рекомбинантного форм бактериородопсина в фемто- и пикосекундном диапазоне времени и проведена оценка эффективности работы рекомбинантного бактериородопсина как модели «сверхбыстрого фотохромного переключателя». (Совместно с ИБХФ РАН, ИХФ РАН и ИБХ РАН). 2. Исследована супрамолекулярная организация фоторецепторной мембраны при помощи метода малоуглового рассеяния нейтронов с вариацией контраста. Показано, что плотность упаковки молекул родопсина в фоторецепторной мембране необычайно высока: расстояние между центрами молекул составляет примерно 56 Å. На основании полученных данных сделано предположение о том, что родопсин в фоторецепторной мембране, скорее всего, находится в мономерной форме. (Совместно с Лабораторией нейтронной физики имени И.М. Франка Объединенного Института Ядерных Исследований, Дубна). 3. Исследование механизмов спектральной настройки зрительных пигментов и спектральной чувствительности глаза ракообразных – морской и озёрной популяций креветок Mysis relicta (род Mysis; Mysida, Crustacea), обитающих в различной световой среде, показало, что их различающиеся по спектрам поглощения зрительные пигменты (λmax ≈ 560 и 530 нм) содержат один и тот же хромофор – А1 ретиналь. Поскольку белковая (опсины), судя по анализу ДНК и mРНК, (Audzijonyte et al., 2012), и хромфорная (ретиналь А1) части у этих пигментов не различаются, причина различия в их спектрах поглощения требует дальнейшего исследования. Определен изомерный состав ретиналей в зрительных пигментах креветок Mysis relicta морской и озёрной популяций в темноадаптированном и светоадаптированном состояниях. Получены предварительные результаты по определению времени темновой регенерации зрительного пигмента у креветок обеих популяций после световой адаптации. Показано, что у креветок морской популяции процесс темновой регенерации протекает быстрее по сравнению с озерной (Совместно с Хельсинским Университетом, Финляндия). 4. Исследованы состав и спектральные характеристики флуорофоров (бис-ретиноидов) липофусциновых гранул, выделенных из клеток ретинального пигментного эпителия 42 кадаверных глаз от доноров разных возрастов (17-78 лет). Показано, что с возрастом происходит повышение относительного содержания как основного флуорофора липофусциновых гранул (А2Е), так и продуктов его фотоокисления и фотодеградации. При этом во флуоресценцию суммарного хлороформного экстракта, полученного из ретинального пигментного эпителия, основной вклад вносят не А2Е и его изо-формы, а продукты фотоокисления и фотодеградации бисретиноидов. Методом послойного «травления» образца ионами цезия (Cs+) получены масс-спектры тонких срезов образцов, содержащих выделенные липофусциновые гранулы (ЛГ) из клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) кадаверных глаз человека. Показано, что основное количество А2Е и продуктов его окисления накапливается во внутренних слоях гранул, в то время как в поверхностном слое они присутствуют лишь следовых количествах на фоне высокого содержания липидов. Внутри гранулы распределение A2E и его окисленных форм, судя по предварительным данным, является равномерным. Кроме того, показано, что внутренняя структура и распределение флуоресценции по грануле неоднородны. Были получены отдельные фракции хлороформного экстракта ЛГ, выделенных из клеток РПЭ при помощи ВЭЖХ. Были зарегистрированы спектры поглощения и флуоресценции этих фракций. Дана количественная оценка вклада отдельных флуорофоров или их групп в общую флуоресценцию хлороформного экстракта из ЛГ. Данные получены для образцов кадаверных глаз доноров без признаков патологии.Полученные результаты будут важны для усовершенствования неинвазивного метода диагностики дегенеративных заболеваний сетчатки – аутофлуоресцентной диагностики глазного дна. 5. Начато новое направление работы: Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки. Анионный канальный родопсин slow ChloC экспрессирован в культуре нервных клеток, а также in vivo в целом мозге мыши и продемонстрирована его способность эффективно гиперполяризовать плазматическую мембрану нейрона и подавлять возникновение в ней импульсной активности при действии видимого света. Показано, что slow ChloC одинаково эффективно работает как в условиях нейрональной культуры, так и при его экспрессии в целом мозге in vivo.Таким образом, slow ChloC может рассматриваться как эффективный оптогенетический инструмент, способный в ответ на световую стимуляцию гиперполяризовать нейрон и тормозить его физиологическую активность.