ИСТИНА

Микроводоросли в силу относительной простоты организации являются удобным объектом для изучения механизмов преобразования энергии и накопления биомассы фотосинтезирующими организмами. Важной задачей является изучение молекулярных механизмов регуляции процессов трансформации энергии в фотосинтетической мембране в их связи с метаболическими процессами биосинтеза. Выращивание микроводорослей в биофотореакторе позволяет проводить эксперименты по изучению механизмов изменения характеристик фотосинтетического аппарата водорослей в контролируемых условиях в ходе роста культуры. Метод флуоресценции позволяет определять параметры и эффективность работы фотосинтетического аппарата в реальном времени. Анализ характеристик индукционной кривой флуоресценции на разных стадиях роста культуры дает возможность проследить за происходящими изменениями в организации процессов трансформации энергии в клетке. С использованием кинетических моделей процессов в фотосинтетической мембране, идентифицируемых по данным экспериментов в биофотореакторе, планируется оценить параметры реакций переноса электрона и метаболических процессов на разных стадиях культивирования при различных режимах освещения культуры. Анализ изменений констант скоростей реакций ключевых стадий фотосинтетических процессов позволит выявить их связь с характеристиками внутренней среды клетки: редокс условиями, рН, изменением концентраций ключевых метаболитов и кислорода. Понимание механизмов этих процессов необходимо для оценки эффективности режимов биофотореактора при выращивании микроводорослей с целью оптимизации выхода биомассы или других целевых продуктов.

Microalgae are convenient objects for studying the mechanisms of energy conversion and biomass accumulation of photosynthetic organisms because of their relative simplicity of the organization. An important task is to study the molecular mechanisms of regulation of energy transformation processes in algae photosynthetic membrane in their relationship with the metabolic processes of the biosynthesis. Growing algae in fotobio-reactor allows to study how algae photosynthetic characteristics change in a controlled environment during the culture growth. Fluorescence method allows to define the parameters and the efficiency of the photosynthetic apparatus in a real time. An analysis of fluorescence induction curve at different stages of culture growth makes it possible to monitor the changes taking place in the organization of energy transformation processes in the cell. Using kinetic models of the processes in photosynthetic membrane, we estimated the parameters of electron transfer reactions and metabolic processes at different stages of cultivation under different protocols of illumination. Analysis of changes in the rate constants of key stage reactions of photosynthetic processes reveals their relationship with the characteristics of the environment of the cell: redox conditions, pH, changes in the concentrations of key mineral nutrients and oxygen. Understanding the mechanisms of these processes is necessary to optimize the operation of the fotobio-reactor for growing microalgae in order to optimize yield or biomass or desired products of microalgae growth.

Контроль состояния фотоавтотрофных микроорганизмов в режиме реального времени дает большие возможности для изучения механизмов регуляции фотосинтетических процессов при выращивании в фотобиореакторе. Спектры поглощения позволяют определять биомассу и пигментный состав фототрофных микроорганизмов, а параметры флуоресценции хлорофилла этих организмов - оценивать функциональное состояние их фотосинтетического аппарата. Система контроля состояния фотоавтотрофных микроорганизмов в фотобиоректоре должна быть приспособлена к измерениям в суспензиях с высокой оптической плотностью. Эта система должна работать в автоматическом режиме и регулярно выдавать информацию не только о спектральных параметрах микроорганизмов, но также о концентрации кислорода и рН среды инкубации фотоавтотрофных микроорганизмов. Ключевым показателем, значения которого будут определены автоматически с высокой частотой, является относительная переменная флуоресценция хлорофилла (Fv/Fm). Она характеризует эффективность, с которой комплекс фотосистемы 2 осуществляет разделение электрических зарядов при поглощении квантов света (коэффициент полезного действия преобразователя одного вида энергии в другой). Снижение Fv/Fm обычно наблюдается на поздних стадиях роста культуры и в целом говорит об ухудшении работы фотосинтетического аппарата. Для получения более полной картины того, что происходит с фотосинтетическим аппаратом водорослей в процессе культивирования, будут привлечены дополнительные методы исследования: хроматографический анализ пигментного состава клеток, измерение спектров возбуждения флуоресценции, определение времени жизни флуоресценции хлорофилла, регистрация индукционных кривых замедленной флуоресценции, оценка скорости переноса электрона от ФС2 к ФС1 по кинетикам восстановления реакционного центра ФС1, построение световых кривых скорости электронного транспорта и нефотохимического тушения. Эти измерения планируется проводить в определенные дни на пробах водорослей, отбираемых из фотобиореактора. При этом слишком частого отбора проб можно избежать, опираясь на данные атоматизированного приборного комплекса. Так, подробный анализ всех перечисленных показателей состояния клеток имеет смысл проводить только при переходе культуры клеток от одной стадии роста к другой, что с достаточной точностью может быть установлено по динамике количества клеток и параметра Fv/Fm. Моменты, в которые культура клеток оказывается в неблагоприятных условиях, можно также выявить по увеличению в соотношении между содержанием каротиноидов и хлорофилла (по спектрам поглощения). Важную для выбора оптимального режима культивирования информацию даст измерение световых кривых скорости электронного транспорта (по флуоресценции хлорофилла). Эти кривые имеют максимум, положение которого соответствует той интенсивности света, при которой достигается максимальная продукция по кислороду. Если текущая интенсивность освещения в биореакторе превышает оптимальную величину – начинается фотоповреждение клеток. Если интенсивность освещения меньше оптимальной – происходит замедление роста культуры. Положение максимума на световой кривой сильно зависит от вида клеток, температуры, содержания углекислоты, фосфора и азота в среде, поэтому на разных стадиях культивирования интенсивность освещения необходимо корректировать в нужном направлении. Для получения количественной информации из экспериментальных данных необходимо использование математических моделей. • Эксперимент. Эксперимент. Микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii будут выращены в 50 л фотобиореакторе кольцевого типа, разработанном в группе проф. С.И.Погосяна на каф. биофизики Биологического факультета МГУ. Фотобиореакор будет снабжен автоматическим измерительным комплексом, который периодически осуществляет забор пробы из биореакора и проводит в ней измерения следующих величин:кривая индукции флуоресценции хлорофилла с микросекундным временным разрешением; спектр поглощения в области 400 – 800 нм; концентрация растворенного кислорода; pH; температура. В состав измерительного комплекса входит устройство отбора проб, флуориметр, спектрофотометр, ячейка для электрохимических измерений (pH и [O2]) и блок управления, считывающий данные с приборов и направляющий их в компбьютер. Флуориметр для измерения параметров флуоресценции хлорофилла микроводорослей по принципу действия соответствует полученному нами патенту «Способ флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, устройство для его осуществления и измерительная камера». Патент на изобретение РФ №2354958 зарегистрирован 10.05.2009. Технические характеристики флуориметра: • Чувствительность по хлорофиллу «а» 0,05 – 100 мг/л • Длительность импульса измерения «F0» 5 мкс • Длительность импульса измерения «Fm» 1с • Период следования импульсов измерения Fo 250 мс • Длина волны возбуждающего света 455 нм Длина волны регистрации флуоресценции > 680 нм • Пиковая интенсивность возбуждающего света 1000 Вт/м2 • Питание по USB-порту • Потребляемый ток менее 0,5 А • Габариты 135х45х65 мм • Масса прибора 0,25 кг Измерение параметров флуоресценции хлорофилла суспензии фототрофных микроорганизмов производится в проточной камере при возбуждении светом, направляемым под углом 45 градусов к передней стенке камеры. Регистрация флуоресценции проводится перпендикулярно передней стенки камеры. Спектры поглощения суспензии микроводорослей будут измерены на спектрофотометре, разработанном на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ. Источник света – стабилизированная по напряжению питания галогеновая лампа мощностью 10 Вт. Свет от лампы падает на переднюю стенку проточной кюветы с оптическим путем 2 мм. С противоположной стороны от кюветы находится интегрирующяя сфера, предназначенная для сбора рассеянного и прямого светового потока. Из сферы свет попадает на спектрометр USB2000 (Ocean Optics, США), внутри которого происходит разложение света в спектр и определение интенсивности света в 2000 спектральных каналах в диапазоне 350 - 900 нм. Культивирование предполагается проводить в течение 2 - 14 дней при различных режимах освещения, перемешивания и барботации. 2. Анализ индукционных кривых флуоресценции с помощью детальной кинетической модели процессов в фотосинтетической мембране. Для анализа изменений характеристик фотосинтетического аппарата, происходящих в ходе роста культуры, будут использованы детальные математические модели, описывающие процессы электронного транспорта в ФС2, ФС1, цитохромном комплексе, трансмембранные потоки протонов и других ионов и роль буферных групп в люминальном и стромальном компартментах тилакоида. Разработанные ранее авторами проекта модели (Ризниченко и др., 2009, 2011, Rubin, Riznichenko, 2009; Беляева и др., 2006, 2011; Beljaeva et al., 2008, 2011) будут параметризованы. Их параметры будут идентифицированы путем фитирования модельными кривыми соответствующих экспериментальных кривых индукции флуоресценции, полученных в ходе роста культуры при различных условиях выращивания. Проведенный анализ позволит установить, какие реакции в цепи фотосинтетического электронного транспорта меняют свою интенсивность в ходе роста культуры. Будут выявлены изменения редокс состояния отдельных переносчиков и сдвиги рН в люминальном и стромальном пространстве тилакоида, возникающие в ходе роста культуры. Будет проведена оценка интенсивности линейного и циклического электронных потоков на отдельных стадиях роста. 3. Анализ изменений характеристик первичных процессов фотосинтеза с помощью редуцированных моделей Фитирование экспериментальных кривых индукции флуоресценции с помощью детальной кинетической модели представляет собой достаточно трудоемкую процедуру. Такой анализ предполагается проводить в отдельные моменты времени роста культуры, соответствующие качественно различным типам кривой индукции флуоресценции (положение максимума, наличие точек перегиба). Экспериментальная установка позволяет в непрерывном режиме регистрировать и запоминать большие объемы информации, для анализа которой предполагается использовать модели фотосинтетического электронного транспорта, редуцированные с помощью метода, предложенного авторами проекта для редукции многокомпонентной модели фотосистемы 2 (Плюснина и др., 2012, Плюснина и др., 2013). Этот подход будет использован для построения упрощенной кинетической модели, включающей основные стадии электронного транспорта в первичных реакциях фотосинтеза. Он позволяет количественно описывать кривые индукции флуоресценции и оценивать параметры элементарных стадий благодаря выведенным соотношениям между параметрами полной и редуцированной моделей. Для оценки вклада отдельных составляющих фотосинтетического аппарата в модель будет включено описание цитохромного комплекса, фотосистемы 1, а также подвижных переносчиков – пластохинона, пластоцианина, ферредоксина. Для оценки взаимовлияния первичных процессов фотосинтеза и энергетического статуса клетки в модель будут включены описания функционирования АТФазы и NADH дегидрогеназы. Параллельно будет проводиться непосредственный анализа экспериментальных индукционных кривых флуоресценции, для чего предполагается модифицировать метод Штрассера (Strasser et al., 2004), где отдельные стадии кривой привязаны к временам, характерным для фотосинтетических реакций в листьях высших растений. Для получения независимых от объекта характеристик стадий ИК предполагается использовать разложение ИК на экспоненты и последующее преобразование формул, анализ ИК различных автотрофных объектов, в частности микроводорослей разных видов в ходе их роста в фотобиореакторе. Оценки изменений фотосинтетического аппарата, полученные на детальной и редуцированной моделях и из непосредственного анализа экспериментальных кривых, будут дополнять друг друга и позволят получить более полную картину изучаемых процессов. Проведенная работа позволит построить зависимости параметров системы от времени в ходе роста культуры при разных режимах работы фотобиореактора. Сопоставление динамики характеристик фотосинтетического аппарата с динамикой роста биомассы позволит сделать выводы относительно механизмов, определяющих эффективность фотосинтетических процессов и их роль в биологической продуктивности культуры микроводорослей. Будут сформулированы условия выращивания культуры, обеспечивающие оптимальную фотосинтетическую продуктивность культуры, соответствующую максимальной биомассе на выходе реактора.

На кафедре биофизики разработаны прототипы фотобиореакторов панельного и кольцевого типа. Проведены эксперименты по выращиванию микроводорослей внутри данных фотобиореакоров при разной освещенности и разном составе среды. Накоплен опыт в построении флуориметров для регистрации кривых индукции флуоресценции хлорофилла в проточном режиме. Патент «Способ флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, устройство для его осуществления и измерительная камера» РФ №2354958. В течение многих лет разрабатываются математические модели первичных процессов фотосинтеза (Ризниченко и др., 2009, 2011; Rubin, Riznichenko, 2009, 2014; Riznichenko et al., 2011. Созданы детальные модели процессов в ФС 2 и мембране хлоропластов (Beljaeva et al., 2008, 2011, 2015, 2016). Предложен подход для анализа биологических систем большой размерности, для которых справедливы предположения о квазиравновесных стадиях (Плюснина и др., 2012). Модели являются оригинальными и соответствуют мировому уровню.

Итоговый отчет по проекту РФФИ 14-04-00326 Рук. Г.Ю.Ризниченко Механизмы регуляции фотосинтетических процессов в клетках микроводорослей в фотобиореакторе по данным флуоресценции с использованием математических моделей Реферат Концепция биотоплива ставит задачи, направленные на понимание механизмов управления метаболическими путями их связи с фотосинтетическим аппаратом клетки. При определенных условиях экологического стресса, в частности, при азотном голодании, некоторые микроводоросли способны переключать метаболические пути в сторону синтеза богатых энергией соединений, таких как крахмал и/или липиды, которые могут быть конвертированы в биотопливо. Анализ экспериментальных кривых индукции флуоресценции является удобным инструментом для оценки активности фотосинтетического аппарата и влияния на него внешних факторов в процессе роста культуры в фотобиореакторе. В ходе выполнения проекта был наиболее создан фотобиореактор панельного типа с системой автоматической регистрации индукционных кривых флуоресценции через каждые 10 минут в процессе роста культуры, создана система автоматической регуляции интенсивности освещения в фотобиореакторе, позволяющая существенно повысить продуктивность культуры. Проведены эксперименты по регистрации фотосинтетических характеристик для культуры микроводорослей (Chlorella), выращенной на среде с различным содержанием минеральных элементов и в различных режимах освещения. Параметры фотосинтетической цепи на разных этапах роста культуры оценивали с использованием детальной модели фотосинтетического электронного транспорта и специально разработанной упрощенной модели, включающей описание переноса электрона во всей фотосинтетической цепи и процессы хлородыхания. Построены зависимости параметров фотосинтетической цепи от времени культивирования в фотобиореакторе в процессе роста культуры на различных средах. Для обработки больших массивов данных по индукции флуоресценции, регистрируемой в автоматическом режиме в ходе роста культуры, разработан метод мультиэкспоненциальной аппроксимации, реализованный в виде модуля для пакета pyPhotoSyn. Метод позволил выявить динамику фаз индукционной кривой флуоресценции в процессе роста культуры по мере истощения среды, проследить связь фотосинтетических показателей с ростовыми характеристиками и динамикой биомассы в процессе роста культуры Введение Микроводоросли в силу относительной простоты организации являются удобным объектом для изучения механизмов преобразования энергии и накопления биомассы фотосинтезирующими организмами. Важной задачей является изучение молекулярных механизмов регуляции процессов трансформации энергии в фотосинтетической мембране в их связи с метаболическими процессами биосинтеза. Выращивание микроводорослей в биофотореакторе позволяет проводить эксперименты по изучению механизмов изменения характеристик фотосинтетического аппарата водорослей в контролируемых условиях в ходе роста культуры. Метод флуоресценции позволяет определять параметры и эффективность работы фотосинтетического аппарата в реальном времени. Анализ характеристик индукционной кривой флуоресценции на разных стадиях роста культуры дает возможность проследить за происходящими изменениями в организации процессов трансформации энергии в клетке. С использованием кинетических моделей процессов в фотосинтетической мембране, идентифицируемых по данным экспериментов в биофотореакторе, можно оценить параметры реакций переноса электрона и метаболических процессов на разных стадиях культивирования при различных режимах освещения культуры. Анализ изменений констант скоростей реакций ключевых стадий фотосинтетических процессов позволяет выявить их связь с характеристиками внутренней среды клетки: редокс условиями, рН, изменением концентраций ключевых метаболитов и кислорода. Понимание механизмов этих процессов необходимо для оценки эффективности режимов биофотореактора при выращивании микроводорослей с целью оптимизации выхода биомассы или других целевых продуктов. Основные результаты. 1. Выбор культуры. В ходе выполнения проекта были проведены эксперименты по оценке фотосинтетической продуктивности различных видов микроводорослей с целью подбора наиболее продуктивного вида. На начальном этапе были взяты 7 видов водорослей: Ankistrodesmus, Haematococcus, Scotiella, Chlorella, Trebouxia, Stichococcus, Synechocystis. Эксперименты по выращиванию водорослей проводили в колбах и в фотобиореакторе (ФБР). Проведено сравнение фотосинтетических характеристик водорослей в контроле и в условиях умеренного дефицита азота. Экспресс-оценка функционального состояния фотосинтетической электрон-транспортной цепи была получена с помощью световых кривых фотосинтеза и измерения индукционных кривых флуоресценции. Среди всех рассматриваемых культур Chlorella обладала самым низким нефотохимическим тушением, то есть наименьшими энергетическими потерями в процессе преобразования световой энергии при высокоинтенсивном освещении (условия, типичные для фотобиореакторов). По этой причине культура Chlorella была выбрана для последующего изучения динамики параметров флуоресценции хлорофилла в процессе роста культуры. 2. Измерение фотосинтетических характеристик на культуре микроводорослей Chlorella, выращиваемых в фотобиореакторе. 2.1 Характеристики фотобиореактора. Для проведения экспериментов по выращиванию культуры микроводорослей и изучения связи параметров флуоресценции хлорофилла с ростовыми характеристиками нами был собран фотобиореактор (ФБР) панельного типа объемом 1,1 л. Он состоит из плоского прозрачного сосуда с крышкой и основания, на котором размещен источник питания и световая панель размером 24 см х 20 см. Панель собрана из светодиодных лент теплого белого цвета и в пределе дает 900 мкмоль•м-2•с-1 фотонов на передней стенке ФБР. В крышке сосуда установлена трубка аэратора и пеногаситель (воронка). На нижнем конце трубки находится керамический распылитель. От распылителя пузырьки воздуха поднимаются к поверхности, обеспечивая газообмен и циркуляцию жидкости вдоль стенок фотобиореактора и между ними. На неосвещенной стенке ФБР размещен термостат. В экспериментах с термофильным штаммом Chlorella температуру поддерживали на уровне 36±1С. Подобран оптимальный спектр светодиодной панели для облучения ФБР. Культивирование водорослей проводили при помощи световой панели «warm white» c максимальной интенсивностью ФАР 900 мкмоль∙м-2∙с-1. 2.2 Измерения индукционных кривых флуоресценции Изменения индукционных кривых флуоресценции хлорофилла водорослей (Chlorella) в начале работ (2014 г) проводили на созданном нами ранее флуориметре Mega-25 на пробах, взятых из ФБР или из колб. Изменение величины относительной переменной флуоресценции хлорофилла Fv/Fm в процессе роста были сопоставлены с содержанием азота в среде, количеством активных реакционных центров ФС2 (по замедленной ФХ), содержанием хлорофилла на клетку, и отношением каротиноиды/хлорофилл. Отмечено, что фазе экспоненциального роста предшествует увеличение параметра Fv/Fm и увеличение количества активных реакционных центров фотосистемы 2 в пересчете на клетку. В фазе экспоненциального роста параметр Fv/Fm достигает уровня 0.75 и начинает существенно снижаться только ближе к стационарной фазе роста, когда в среде полностью заканчиваются запасы минерального питания. До перехода культуры в стационарную фазу на ростовой кривой выделяется довольно продолжительный переходный участок, на котором относительная скорость роста (μ) падает в несколько раз, но практически не наблюдается снижения Fv/Fm (>0.65). Таким образом, при умеренном дефиците минерального питания параметр Fv/Fm, определенный стандартным способом - после темновой адаптации, не связан с реальной скоростью деления клеток. Известно, что в условиях минерального дефицита скорость электронного транспорта снижается, и часть реакционных центров ФС2 под действием светового облучения ФБР переходит в закрытое состояние (увеличение Fo). Также на фотосинтетических мембранах развиваются процессы нефотохимического тушения. Однако, чтобы обнаружить эти события по индукционным кривым флуоресценции необходимо сокращать время между взятием пробы и измерением флуоресценции хлорофилла. Уменьшить это время до нескольких секунд и обеспечить хорошую воспроизводимость временного интервала удалось с помощью автоматизированного фотометрического комплекса, созданного в 2015 г. В экспериментах на ФБР было выявлено, что на богатых питательных средах интенсивность флуоресценции хлорофилла в процессе роста культуры довольно быстро выходит на плато и перестает зависеть от содержания клеток водорослей (эффект экранирования возбуждающего света). Для адекватного измерения численности клеток и содержания основных фотосинтетических пигментов – хлорофилла каротиноидов – в состав автоматизированной системы в дополнение к флуориметру был введен спектрофотометр. При регистрации оптической плотности на спектрофотометре сохраняется линейность показаний в области высоких концентраций клеток пигментов. 2.3 Лимитирующие факторы роста Изучены лимитирующие факторы для зеленой водоросли Chlorella при культивировании в ФБР. Показано, что при высоком содержании хлорофилла в культуре (>5мг/л), несмотря на интенсивное барботирование (1 л/мин на 1-литровый ФБР), клеткам водорослей не хватает атмосферного СО2, и для поддержания высокой скорости деления клеток необходимо искусственное обогащение подаваемого воздуха углекислым газом. Экспериментально установлено, что увеличение концентрации СО2 с 360 ppm до 3600 ppm устраняет лимитирование роста по углекислому газу при сколь угодно большой интенсивности облучения. Временная остановка подачи СО2 приводила к прекращению деления клеток и уменьшению параметра Fv/Fm за счет увеличения Fo. Этот результат указывал на то, что значение Fv’/Fm’, которое теперь удавалось определять с минимальной задержкой после взятия пробы (5 с), действительно стало «реагировать» на изменение скорости роста культуры. Обнаружена строгая линейная связь между конечной биомассой клеток и начальным содержанием минеральных элементов в питательной среде (среда Тамия в разведениях от 1:50 до 1:1). Путем изменения концентрации отдельных компонентов питательной среды доказано, что конечная биомасса клеток лимитирована содержанием азота (для среды Тамия - нитрат калия). Благодаря круглосуточному мониторингу параметров фотосинтеза и высокой частоте измерений установлено, что при исчерпании минерального питания синтез хлорофилла в определенный момент времени останавливается. В этот момент времени концентрация нитратного азота в среде оказывается ниже 10-5М (10-2М в исходной среде Тамия 1:5). После прекращения синтеза хлорофилла количество каротиноидов в культуре продолжает увеличиваться, увеличивается и количество клеток в суспезии, но клетки при этом уменьшаются в размерах. От момента окончания синтеза хлорофилла до момента остановки деления клеток, число клеток приблизительно удваивается. 2.4 Автоматическое регулирование интенсивности освещения ФБР на основе данных о текущем значении Fv/Fm в клетках В ходе ростовых экспериментов, в которых параметр Fv/Fm измерялся с высокой частотой, было замечено, что культура водорослей на протяжении своего роста дважды оказывается в неблагоприятных условиях по освещению. Первый раз – на начальном этапе, когда клетки еще не приспособились к интенсивному свету, а второй раз - в тот момент, когда концентрация клеток увеличивается настолько, что клетки начинают заслонять друг друга и внутри ФБР возникает дефицит освещения. Было организовано автоматическое регулирование интенсивности освещения ФБР на основе данных о текущем значении Fv/Fm в клетках. (2015 г). В том случае, когда Fv/Fm в клетках водорослей снижается ниже оптимального уровня 0.55, система автоматически уменьшает интенсивность освещения ФБР. Если Fv/Fm оказывается выше 0.55, то это говорит о недостаточной загрузке электрон-транспортной цепи хлоропластов, и система компенсирует недостаток света путем увеличения яркости световой панели ФБР. После пересадки культуры водорослей в малой концентрации на свежую среду интенсивность освещения ФБР автоматически устанавливалась на уровне порядка 10-15% от максимально возможной. Затем, по мере того как клетки адаптировались к новым условиям, интенсивность света плавно увеличивалась до 20-30%. И в тот момент, когда в культуре возникал эффект затенения, система регулирования увеличивала освещенность до максимального уровня. В опытах показано, что регулирование света позволяет при равных затратах на освещение ФБР получить на 38% больше биомассы клеток. Особенно интересно, что система управления пытается «удержать» значение Fv/Fm на постоянном уровне также и в конце культивирования, когда Fv/Fm начинает снижаться из-за дефицита азота. Возможно, в будущем это явление удастся использовать для устойчивого культивирования водорослей в неблагоприятных условиях, стимулирующих накопление некоторых ценных продуктов метаболизма. Авторегулирование освещения в данном случае не допустит преждевременной гибели водорослей от фотоповреждения. Также система регулирования полезна в условиях действия различных возмущающих факторов, которые неизбежно возникают при длительном непрерывном культивировании – изменение кислотности среды, температуры, содержания углекислого газа, соотношений разных форм азота и т.п. 2.5 Автоматическое измерение индукционных кривых флуоресценции Автоматическое измерение флуоресценции на выходе дает большой массив индукционных кривых (до 200 за эксперимент). Нами создано программное обеспечение для визуализации изменений, которые происходят с фотохимической фазой (OJ) и отдельными участками термальной фазы индукционной кривой (JIP). За счет большого числа переходных вариантов индукционных кривых, можно проследить, как ускоряются или замедляются существующие компоненты индукционной кривой и в какой момент культивирования появляются новые компоненты. Такой подход был опробован нами в экспериментах по выращиванию Chlorella и в экспериментах по серному голоданию Chlamydomonas в фотобиореакторе. Автоматизированный измерительный комплекс позволил существенно сократить время между отбором пробы и измерением индукционной кривой. 3. Обработка и интерпретация экспериментальных данных с помощью математических моделей. 3.1. Детальная модель процессов в фотосинтетической мембране. Выход биомассы микроводорослей в ФБР определяется совокупностью метаболических процессов, происходящих в фотосинтезирующих клетках и потерями энергии, которые имеют место на разных стадиях метаболизма. Начальной стадией поглощения энергии является система первичных процессов фотосинтеза, включающая этапы поглощения световой энергии, фотосинтетический электронный транспорт, сопряженные процессы генерации электрического и электрохимического потенциала, синтез АТФ, наработку восстановительных эквивалентов НАДФ и НАДН, необходимых при функционировании цикла фиксации углерода, синтеза сахаров и далее – белков, липидов, полинуклеотидов и других огранических молекул. На этапе первичных процессов эффективность работы системы определяется степенью согласованности первичных реакций фотосинтеза, индуцируемых светом в фотосистемах 2 и 1 (ФС2 и ФС1), а также эффективностью и результативностью переноса зарядов в компартментах люмена и стромы тилакоида. Важной характеристикой системы является также устойчивость работы фотосинтезирующей системы микроводорослей. Детальные модели процессов в фотосинтезирующих системах позволяют анализировать потери, происходящие при фотосинтетическом запасании энергии световых квантов. Нами была разработана детальная модель электронного транспорта и сопряженных процессов трансформации энергии в тилакоидной мембране (ТМ) (Belyaeva et al., 2016), которая позволяет проследить динамику параметров фотосинтетической цепи переноса электрона в процессе роста культуры и оценить энергетические потери, происходящие на разных этапах трансформации энергии в ходе первичных процессов фотосинтеза. В основу модели ТМ были положены результаты работ (Belyaeva et al., 2014, 2015), в которых были изучены особенности потоков, индуцируемых светом при переносе электронов в ФС2, с учетом сопряженного переноса протонов и реакции безызлучательной диссипации энергии реакционного центра (РЦ) ФС2. Модель изолированной ФС2 (30 компонент в качестве переменных) была использована в качестве субмодели в модели ТМ. Массив параметров, найденных при фитировании модели ФС2 по индукции флуоресценции (ИФ), измеренной на интервале до 2 с, брали за основу при расчетах в многопараметрической модели тилакоидной мембраны, которую фитирования по комплексу измерений ИФ и редокс превращений пигмента P700 РЦ ФС1. В работе (Belyaeva et al, 2016) с помощью модели тилакоидной мембраны проведен детальный анализ световой индукции фотосинтеза образца после темновой адаптации на шкале времени до 20 с после включения света. Модель представляет собой систему из 68 дифференциальных уравнений. Концентрации компонент системы и параметры скоростей реакций идентифицировали одновременно по измерениям быстрых и медленных OJIPSMT фаз ИФ и OABCD поглощения A810 хлорофилла Р700 ФС1 (pdf файл). Модель ТМ описывает изменение концентраций следующих метаболитов: редокс кофакторы реакционных центров (РЦ) ФС2, ФС1 и цитохромного комплекса b6f, пулы подвижных переносчиков (пластоцианин, ферредоксин (Fd), NADP(H)), протоны люмена / стромы HS+ / HL+, противоионы K+, Cl. В модели также производится расчет динамики световой энергизации тилакоидной мембраны в пределах физиологических диапазонов Δψ (t), pHL/S(t) с учетом потоков зарядов в реакциях АТФ-азы, буферных групп, и пассивных утечек H+, K+, Cl. 3.2 Оценка динамики характеристик фотосинтетического электронного транспорта в ходе роста культуры с помощью упрощенной модели процессов в фотосинтетической мембране. На основе моделей, разработанных в (Плюснина и др., 2012, Плюснина и др., 2013), нами была разработана упрощенная модель первичных процессов фотосинтеза на мембране тилакоида, включающая линейный транспорт, циклический транспорт и путь хлоропластного дыхания. Модель включает реакции комплексов фотосистемы II (PSII), цитохромного комплекса b6f (Cyt b6f), фотосистемы I (PSI), ферредоксин-NADPH-редуктазы (FNR), а также подвижных переносчиков – пластохинона (PQ), пластоцианина (PC), ферредоксина (Fd) (файл pdf). Учтенный в модели циклический транспорт вокруг фотосистемы I включает перенос электронов от ферредоксина (Fd) на цитохромный комплекс b6f (Cyt b6f). В модель включены также комплексы, участвующие в альтернативных путях переноса электрона на тилакоидной мембране, NADH-дегидрогеназа (NDH), пластидная терминальная оксидаза (PTOX). Генерация протонного градиента и синтез ATP осуществляется потенциал зависимой протонной ATPсинтазой. Для идентификации модели мы использовали данные измерений индукции флуоресценции, зарегистрированные в ходе роста клеток микроводоросли Chlorella в фотобиореакторе. В процессе роста клеток каждый час снимали кривые индукции флуоресценции. Поскольку временной диапазон экспериментально измеряемых процессов охватывает в основном процессы с участием ФС2, для идентификации параметров мы использовали блок модели, включающей описание переноса электронов внутри ФС2 и восстановление пластохинона, как за счет переноса электронов с ФС2, так и за счет хлородыхания – с NADH-дегидрогеназы. Все значения констант переноса электронов внутри комплекса ФС2 – (перенос электронов от КВК, разделение зарядов, перенос первого электрона на Qb, перенос второго электрона на Qb) фиксировали на основе известных литературных данных. Для фитирования было выбрано 4 параметра модели – световая константа kL, отражающая изменения в антенном комплексе, константа рекомбинации krec, константа скорости восстановления пула пластохинонов kpq за счет ФС2, константа скорости восстановления пула пластохинона за счет процессов хлородыхания kred. Фитирование кривых индукции флуоресценции в разные часы роста клеток микроводоросли Chlorella показало хорошее совпадение модельных и экспериментальных кривых. Анализ изменения параметров в процессе роста культуры показывает, что в процессе роста культуры в фотобиореакторе первые 28 часов после помещения культуры в фотобиореактор происходит адаптация клеток к новым условиям роста и к новому световому режиму за счет изменения эффективной площади сечения антенны и взаимодействия электронных потоков, после адаптации в клетках активизируется ФС2 и снижается хлоропластное дыхание, однако после 46 часов роста в фотобиореакторе активность фотосинтеза вновь начинает падать за счет истощения среды и значительного увеличения плотности популяции. 2.2 Программный комплекс для экспресс анализа ОJIP кривых индукции флуоресценции с помощью разложения их на сумму экспонент Для обработки больших массивов данных по индукции флуоресценции, регистрируемых в автоматическом режиме в ходе роста культуры, в рамках проекта был разработан программный комплекс, позволяющий проводить JIP-тест кривых и анализировать их с помощью разложения на сумму экспонент (Плюснина и др., 2015). В основе метода лежит аппроксимация кинетики индукции флуоресценции мультиэкспоненциальным рядом с фиксированными характерными временами. Результат аппроксимации входного сигнала F(t) представляет собой набор амплитуд, соответствующих выбранным фиксированным временам tn. Предложенный метод анализа данных индукции флуоресценции был реализован в виде модуля для пакета pyPhotoSyn, описанного нами нами в (Плюснина и др., 2015). Разработанный нами в рамках проекта метод мультиэкспоненциальной аппроксимации кривой индукции флуоресценции (Плюснина и др 2015) позволил выявить динамику фаз индукционной кривой в процессе роста культуры по мере истощения среды, проследить изменение их количества и таких характеристик как амплитуда и характерное время. Метод позволяет обрабатывать большие наборы данных и применяется нами для анализа индукционных кривых в процессе роста культуры при различных режимах освещения. Заключение В ходе выполнения проекта был наиболее создан фотобиореактор панельного типа с системой автоматической регистрации индукционных кривых флуоресценции через каждые 10 минут в процессе роста культуры. Создана система автоматической регуляции интенсивности освещения в фотобиореакторе, позволяющая существенно повысить продуктивность культуры. Проведены эксперименты по регистрации фотосинтетических характеристик для культуры микроводорослей (Chlorella), выращенной на среде с различным содержанием минеральных элементов. Выполнены эксперименты по оценке лимитирующих факторов роста культуры. Параметры фотосинтетической цепи на разных этапах роста культуры оценивали с использованием детальной модели фотосинтетического электронного транспорта и специально разработанной упрощенной модели, включающей описание переноса электрона во всей фотосинтетической цепи и процессы хлородыхания. Построены зависимости параметров фотосинтетической цепи от времени культивирования в фотобиореакторе в процессе роста культуры на различных средах. Для обработки больших массивов данных по индукции флуоресценции, регистрируемой в автоматическом режиме в ходе роста культуры, разработан метод мультиэкспоненциальной аппроксимации, реализованный в виде модуля для пакета pyPhotoSyn. Метод позволил выявить динамику фаз индукционной кривой флуоресценции в процессе роста культуры по мере истощения среды, проследить связь фотосинтетических показателей с ростовыми характеристиками и динамикой биомассы в процессе роста культуры. В ходе выполнения проекта было опубликовано 8 статей в рецензируемых журналах, 3 статьи в сборниках. 18 тезисов докладов.