ИСТИНА

Проект посвящен исследованию механизмов взаимодействия генетических систем, контролирующих продукцию и поглощение водорода в клетках цианобактерий, и разработке генно-инженерных методов создания штаммов, способных к эффективной продукции молекулярного водорода на основе биоконверсии солнечной энергии. В работе предлагаются новые методические подходы для идентификации и функционального анализа структурных и регуляторных генов, контролирующих процессы выделения / поглощения водорода в клетках модельного объекта Anabaena variabilis ATCC 29413, получение новых и изучение выделенных ранее уникальных мутантов Anabaena variabilis, продуцирующих водород при азотфиксации в аэробных условиях, а также скрининг неизученных ранее штаммов гетероцистных цианобактерий с целью получения высокоэффективных продуцентов водорода с помощью современных методов генетики и генетической инженерии цианобактериальных систем. Планируемые в проекте генетические исследования направлены на получение принципиально новых научных результатов, позволяющих выйти на решение задач по созданию нового типа штаммов-продуцентов фотоводорода, обладающих технологической рентабельностью.

Для решения задач клонирования генов, контролирующих у цианобактерий метаболизм водорода, разработаны необходимые методические подходы. Оптимизированная система конъюгативного переноса генов у Anabaena variabilis ATTC 29413 использована для клонирования сегмента кластера hox-генов, инактивированного инсерцией с кассетой устойчивости к гентамицину. Получен мутант по гену hox H и таким образом показана применимость этой системы для идентификации генов-кандидатов, мутации в которых (PK-17 и PK-84) повышают уровень фотопродукции водорода в результате снижения активности поглощающей гидрогеназы. На мобилизуемом интегративном плазмидном векторе pRL498 создан банк Hind-III фрагментов ДНК дикого типа A.variabilis. Осуществлена низкочастотная трансформация PK-17 и PK-84 мутантов фракциями геномного банка путем отбора рекомбинантов по признаку устойчивости к менадиону, которая понижена у мутантов. Созданный банк фрагментов ДНК пригоден для поиска и клонирования генов-кандидатов, контролирующих активность поглощающей гидрогеназы. Другое направление исследований связано с поиском новых штаммов цианобактерий, продуцирующих молекулярный водород. Среди 8 исследованных штаммов Anabaena и Nostoc различного происхождения обнаружен новый штамм Anabaena sp.182, способный к фотопродукции водорода в микроаэрофильных условиях. С помощью набора праймеров и ПЦР-амплификации показана относительно высокая степень гомологии консервативных участков генов hox- и hup-кластеров у штамма Anabaena sp.182 и референтного штамма Anabaena variabilis. Эти данные свидетельствуют о генетической близости двух штаммов, что подтверждается их сходством по 3-м маркерным инвертированным межгенным повторам, расположенным в разных участках генома. Штамм Anabaena sp.182, обладающий рядом физиологических, ростовых достоинств, будет использован в качестве перспективного объекта генетических исследований, направленных на получение эффективных продуцентов фотоводорода.Для решения задач клонирования генов, контролирующих метаболизм водорода у цианобактерий, разработаны необходимые методические подходы. Оптимизированная система конъюгативного переноса генов у Anabaena variabilis использована для клонирования, идентификации и функционального анализа генов, контролирующих процессы выделения/поглощения водорода у A.variabilis. На мобилизуемом интегративном плазмидном векторе pRL498 создан банк Hind-III фрагментов ДНК дикого типа A.variabilis. B геномном банке выявлены клонированные Hind-III фрагменты ДНК дикого типа A.variabilis, дающие менадионрезистентные рекомбинанты у менадиончувствительных мутантов PK17 и PK84, продуцирующих водород в аэробных условиях в результате снижения активности поглощающей гидрогеназы. Созданный банк фрагментов ДНК пригоден для поиска и клонирования генов-кандидатов, контролирующих активность поглощающей гидрогеназы. Другое направление исследований связано с поиском новых штаммов цианобактерий, выделяющих молекулярный водород. Изучены физиологические и молекулярно-генетические особенности ранее выявленного ассоциативного штамма Anabaena sp.182, способного к фотопродукции водорода в микроаэрофильных условиях. В результате тестирования шести независимо выделенных штаммов Anabaena azollae (свободнорастущих минорных симбионтов папоротника Azolla) отобраны два штамма (A azollae 5 и A azollae 7) с высокими уровнями фотопродукции водорода, превышающими уровни A.variabilis и Anabaena sp.182. С помощью ПЦР-амплификации со специфическими праймерами и с праймерами к многокопийным межгенным инвертированным повторам в геноме A.variabilis (Rep-праймерами) показана высокая степень генетического сходства участков hox- и hup-кластеров генов, а также близкое родство структуры геномов в целом у штаммов A.variabilis, Anabaena sp.182, A azollae 5 и A azollae 7. Предложено использовать Rep-праймеры для генотипирования штаммов цианобактерий. С помощью метода RAPD-ПЦР выявлен генетический полиморфизм между отобранными близкородственными штаммами Anabaena, что позволяет использовать этот метод для выявления и идентификации генетических элементов и/или мутаций, влияющих на уровень фотовыделения водорода у цианобактерий. Вновь выявленные штаммы гетероцистных цианобактерий будут использованы в качестве объектов генетических исследований, направленных на получение эффективных продуцентов фотоводорода.