| 1 |
1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Исследование воздействия бета-N-метиламин-L-аланина (ВМАА) на метаболизм клеток цианобактерий: молекулярно-генетический, биохимический и физиологический подходы. |
| Результаты этапа: Целью проекта является изучение молекулярных основ взаимодействия цианобактериальной клетки с нейротоксичной небелковой аминокислотой ВМАА, образуемой цианобактериями. Известно, что ВМАА связывается с глутаматовым рецептором в мозге человека и животных. Подобные рецепторы обнаружены у растений и у цианобактерий. Какова роль глутаматового рецептора в клетках цианобактерий? Каковы молекулярные основы устойчивости (чувствительности) клеток цианобактерий к ВМАА?
На 2014 год были поставлены следующие цели:
• Исследование воздействия ВМАА на клетки дикого типа и мутанта цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120, лишенного глутаматового рецептора (GluRO мутант). Изучение воздействия токсина на рост, фиксацию азота, фотосинтез и обмен кальция в клетках мутанта в сравнении с клетками дикого типа.
• Получение транспозонных мутантов цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120, устойчивых к ВМАА.
Полученные в 2014 году важнейшие результаты
1. Показано,что мутант цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 по гену all2911, лишенный глутаматового рецептора (GluRO), обладает более высоким уровнем устойчивости к ВМАА при росте на среде, содержащей связанный азот.
2. В условиях азотфиксации, мутант GluRO по уровню устойчивости к ВМАА практически не отличается от дикого типа.
3. Обнаружено, что ВМАА полностью ингибирует активность нитрогеназы в клетках дикого типа.
4. У мутанта GluRO нитрогеназная активность отсутствует.
5. Мутант GluRO не образует гетероцист - специализированных дифференцированных клеток цианобактерий, содержащих нитрогеназу, главный фермент, осуществляющий фиксацию атмосферного азота.
6. Предварительные исследования позволили отметить заметное увеличение потока кальция в клетках дикого типа при добавлении ВМАА. Уровень внутриклеточного кальция повышается примерно на 60%.
7. В клетках мутанта GluRO, лишенного глутаматного рецептора, добавление ВМАА не вызывает заметных изменений в концентрации внутриклеточного кальция.
8. С целью идентификации новых генов цианобактерий, контролирующих устойчивость к ВМАА, был проведен транспозонный мутагенез клеток Anabaena sp. PCC 7120 и были отобраны 12 мутантов, устойчивых к ВМАА. Предварительные эксперименты показали, что мутанты отличаются от мутанта GluRO.
|
| 2 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Исследование эффекта ВМАА на клеточную дифференцировку и метаболизм цианобактерий |
| Результаты этапа: Впервые обнаружено и изучено влияние ВМАА на клеточную дифференцировку цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120.В ходе проведенного нами исследования было показано, что различные концентрации ВМАА приводят к подавлению активности фермента нитрогеназы в уже сформированных гетероцистах культуры Nostoc sp. PCC 7120, растущей в условиях азотфиксации, что согласуется с данными шведских ученых о действии 50 мкМ ВМАА на нитрогеназную активность этой цианобактерии. С помощью методов флуоресцентной микроскопии нами впервые показано, что добавление экзогенного ВМАА приводит к ингибированию формирования гетероцист в условиях голодания по азоту в культуре дикого типа цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120.
Мы обнаружиди, что в условиях роста в присутствии нитрата или аммония, препятствующих образованию гетероцист, добавление ВМАА к клеткам цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120, вызывает дерепрессию гетероцист, а именно образование гетероцисто-подобных клеток. С помощью метода восстановления ацетилена мы определили, что эти клетки не обладают нитрогеназной активностью. Таким образом, экзогенно добавленный ВМАА в низких концентрациях (20-100 мкМ) приводит к изменениям в процессе клеточной дифференцировки нитчатой цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120.
Проведен филогенетический анализ глутаматного рецептора 17 видов цианобактерий на основании аминокислотных последовательностей, подобранных по последовательностям гомологичного белка Synechocystis sp. PCC 6803 и Nostoc sp. PCC 7120. В качестве филогенетического маркера, используемого для сравнения, был выбран ген малой субъединицы рибосомной РНК – 16S рРНК. Показано,что в один кластер с Silicibacter (референтный вид)вошли преимущественно нитчатые, формирующие гетероцисты, азотфиксирующие виды цианобактерий, что позволяет предположить общее происхождение GluR у представителей родов Nostoc, Anabaena, Calothrix. В другой кластер вошли одноклеточные диазотрофные и недиазотрофные морские и пресноводные цианобактерии. Сделан вывод о том,что в ходе эволюции имели место два горизонтальных переноса генов, кодирующих глутаматный рецептор.
Опубликована статья, посвященная перспективному объекту исследования - новой цианобактерии Nostoc PTV, повышающей урожайность люцерны в ассоциации с ризобиями. Karaushu EV, Lazebnaya IV, Kravzova TR, et al. Biochemical and Molecular Phylogenetic Study of Agriculturally Useful Association of a Nitrogen-Fixing Cyanobacterium and Nodule Sinorhizobium with Medicago sativa L. Biomed Res Int. 2015;2015:202597. doi: 10.1155/2015/202597. Этот организм может быть интересен как возможный источник ВМАА, поставляющий эту небелковую аминокислоту растению, находясь с ним в ассоциации.
Подготовлен к печати обзор Попова А.А., Кокшарова О.А. " Нейротоксичная небелковая аминокислота ВМАА и ее роль в биологических системах".
Подготовлена к печати рукопись экспериментальной статьи Popova A.A., Semashko T.A., Rasmussen U.,Koksharova O.A. Effect of Exogenous betta-N-Methylamino-L-alanine on the cell differentiation of the cyanobacterium Nostoc sp. PCC 7120.
Подготовлена к печати рукопись статьи по филогении глутаматного рецептора у цианобактерий Lazebny O.E., Lazebnaya I.V., Popova O.A., Koksharova O.A. The phylogenetic analysis of glutamate-like receptors of phototrophic organisms: the first overlook.
Результаты исследований представлены на четырех научных конференциях.
|
| 3 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Исследование эффекта ВМАА на клеточную дифференцировку и метаболизм цианобактерий |
| Результаты этапа: В ходе работы впервые было обнаружено, что небелковая аминокислота ВМАА ингибирует образование гетероцист при истощении азота в среде и инициирует формирование гетероцистоподобных клеток на среде со связанным азотом в культуре нитчатой азотфиксирующей цианобактерии N. 7120. Было исследовано действие ВМАА на экспрессию генов, вовлеченных в азотный метаболизм, и впервые показано, что ВМАА участвует в регуляции дифференцировки клеток N. 7120. Полученные в работе данные имеют большое значение для дальнейших фундаментальных исследований молекулярных механизмов регуляции азотного метаболизма и клеточной дифференцировки азотфиксирующих цианобактерий, а также в экотоксикологических исследованиях, направленных на контроль за аккумуляцией ВМАА в природе.
Небелковая аминокислота ВМАА ингибирует нитрогеназную активность зрелых гетероцист цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120 и подавляет экспрессию nifH гена.
ВМАА репрессирует процесс дифференцировки гетероцист в условиях голодания по азоту.
Результаты qRT-PCR демонстрируют подавление экспрессии генов hetR и hepA, кодирующих белки, вовлеченные в формирование гетероцист, в присутствии ВМАА в диазотрофных условиях.ВМАА вызывает образование нефункциональных гетероцистоподобных клеток в культуре цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120 при росте на средах со связанным азотом, что может быть связано с индукцией экспрессии генов hetR и hepA
|
