ИСТИНА

Актуальной и малоизученной проблемой биологии развития растений является изучение генетического контроля формирования и функционирования стволовых клеток, определяющих процессы дифференцировки тканей и органов растений. В программе проекта впервые в России будут исследованы функции недавно открытых генов Arabidopsis thaliana (модельного объекта молекулярной генетики растений) с целью построения генных сетей регуляции образования и поддержания стволовых клеток в процессах онтогенеза. 2. Фундаментальное и прикладное значение имеют работы по изучению молекулярно-генетических механизмов развития резистентности фотосинтезирующих организмов к неблагоприятным условиям (высокая интенсивность света, охлаждение, действие гербицидов и т.п.). На основе использования созданных на кафедре генетики МГУ уникальных коллекций мутантов растений и цианобактерий с измененной чувствительностью к различным стрессовым факторам проводится идентификация и изучение экспрессии новых генов, контролирующих системы адаптации к окислительному стрессу и холодовому воздействию. Эти работы направлены на создание новых форм растений методами генной инженерии. 3. Одной из важных задач фотобиотехнологии является использование цианобактерий в качестве продуцентов молекулярного водорода, как наиболее экологически и экономически выгодного топлива. Важной предпосылкой решения этих задач является выяснение механизмов регуляции метаболизма водорода, клонирование и анализ генов, ответственных за высокий уровень фотопродукции водорода. 4. В свете активно обсуждаемых представлений об участии цианобактерий в процессах эволюции биосферы будут обобщены на основе геномного анализа с помощью методов биоинформатики сведения о роли мобильных генетических элементов и циановирусов в геномной эволюции цианобактерий.

1.Молекулярная генетика и геномика цианобактерий. 1.1.Разработан вектор нового типа для контролируемой экспрессии клонированных генов с использованием платформы, обеспечивающей стабильную интеграцию экспрессионной кассеты в геном цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. Целевой ген встраивают в кассету таким образом, чтобы он оказался трасляционно слит с промотором гена petJ, кодирующего цитохром с533. Промотор гена petJ репрессируется ионами меди и максимальная экспрессия этого промотора достигается при росте рекомбинантного штамма в среде, не содержащей меди. Высокая эффективность этой системы показана на примере конструирования условно-летального мутанта с инсерционной инактивацией гена, кодирующего феррохелатазу, которая вовлечена в биосинтез гема и является жизненно необходимой. У оксигенных фототрофных организмов фитильная группа хлорофилла а образуется из геранилгеранилового предшественника с помощью геранилгеранилредуктазы. Геранилгераниловый остаток входит также в состав токоферолов и филлохинона. С целью выяснения роли фитилирования хлорофилла а проведен сравнительный анализ ранее полученного мутанта с отсутствием геранилгеранилредуктазы и мутантов, у которых отсутствуют токоферолы или филлохинон. Установлено, что рост штамма с отсутствием токоферола не отличался от роста штамма дикого типа в стандартных условиях выращивания. В условиях высокой интенсивности света у этого штамма деградация фотосистемы I проходила с большей скоростью чем у штамма дикого типа. Штамм без филлохинона характеризовался медленным фотоавтотрофным ростом, и мог расти только при низкой освещенности. В условиях сильной освещенности содержание хлорофилла в его клетках не снижалось, что свидетельствовало о стабильности фотосистем. Штамм без геранилгеранилредуктазы был способен только к фотомиксотрофному росту вследствие нестабильности фотосистем I и II. Увеличенное содержание миксоксантофилла в его клетках указывало на проявление фотоокислительного стресса даже при умеренном освещении. В условиях высокой интенсивности света у этого мутанта происходила быстрая деградация обеих фотосистем. Полученные данные позволяют заключить, что фитилирование хлорофилла а играет важную роль в стабилизации фотосистем и является необходимым для фотоавтотрофного роста и устойчивости к свету высокой интенсивности в оксигенных условиях. 1.2. С помощью вектора нового типа сконструирован мутантный штамм с инактивированным геном fur (кодирующим белок-транспортер ионов железа) и содержащий дополнительную копию этого гена под контролем промотора, регулируемого ионами меди. Установлено, что ген fur участвует в регуляции светозависимого пути синтеза хлорофилла и сборке фотосистем, а также вовлечен в регуляцию экспрессии генов системы транспорта сидерофоров (tonB и exbB) и feoA/feoB-зависимой системы транспорта двухвалентного железа. 1.3. Геномный анализ мутантов цианобактерии Anabaena variabilis, продуцирующих молекулярный водород. В целях идентификации мутаций, повышающих продукцию водорода у азотфиксирующих цианобактерий осуществлено полногеномное секвенирование двух ранее полученных нами независимых мутантов Anabaena variabilis (РК17 и РК 84), способных к суперпродукции водорода в атмосфере воздуха. Пиросеквенирование проводили на приборе GPX фирмы Roche, для аннотирования функции генов использовали базу данных (DOE Joint Genome Institute) по референтному штамму Anabaena variabilis, геном которого был секвенирован в 2005 году. Установлено, что геном клеток мутанта РК17 отличается от генома исходного штамма по 97 позициям, из которых 28 локализовано в синонимичных сайтах и некодирующих участках; 18-мисенс-мутаций обнаружено в генах, кодирующих гипотетические белки с неизвестными функциями, более 30 мутаций выявлено в генах, кодирующих протеин-киназы, протеазы, трансферазы, белки транспортных систем. Обнаружено две мутации в генах, которые участвуют в генетическом контроле метаболизма водорода. Мутация в штамме РК-17 локализована в гене hupL, продуктом которого является большая субъединица поглощающей (uptake) гидрогеназы. Эта миссенс-мутация приводит к замене цистеина на тирозин в С-терминальном участке белка, где находится сайт в котором происходит специфическое эндопептидазное отщепление сегмента, необходимое для активации фермента. Эта мутация, подавляющая функцию поглощающей гидрогеназы является причиной увеличения фотопродукции водорода. Другая мутация, которая влияет на Н2-продукцию, выявлена у мутанта РК17 в гене hupF, кодирующем белок, необходимый для «созревания» как поглощающей, так и бинаправленной гидрогеназы. Идентифицированная в этом гене мутация проводит к замещению аспарагиновой кислоты на аспарагин в домене, который вовлечен во взаимодействие с другими Hyp белками, образующими комплекс, ответственный за интеграцию железа в активные центры гидрогеназ. Нарушение функции HypF белка приводит к блокированию (резкому снижению) активности обеих гидрогеназ, что и было показано ранее для мутанта PK84. В геноме мутанта РК84 выявлены также мутации в генах, которые потенциально могут быть вовлечены в генетический контроль Н2 – продукции. Это мутации в гене ферредоксин-тиоредоксин редуктазы, гене Ava3964, кодирующем гипотетический белок с неизвестной клеточной функцией, но обладающий доменом, характерным для некоторых дегидрогеназ. В этом гене, но в разных сайтах, обнаружены мутации как у мутанта РК84, так и у мутанта РК17. Таким образом, на основе полногеномного анализа установлена мутационная природа мутантов, перспективных для использования в биотехнологии, а также выявлены мутации в новых генах-кандидатах, которые могут быть вовлечены в регуляцию процессов водородного метаболизма. В целях поиска новых суперпродуцентов водорода среди гетероцистных цианобактерий осуществлен полногеномный анализ двух эпифитных штаммов Anabaena, выделенных из экосистем рисовых полей Вьетнами. Выявлена высокая степень генетического родства этих штаммов со штаммом A.variabilis и показано, что штаммоспецифичность обусловлена геномным полиморфизмом за счет транспозиции мобильных элементов. Открыта и охарактеризована новая низкокопийная плазмида (2705 нуклеотидов), которая может служить молекулярным маркером для генотипирования гетероцистных цианобактерий. 1.4. Сценарии эволюции геномов цианобактерий. На основе биоинформационного анализа геномов 52 видов и штаммов цианобактерий, а также литературных данных (опубликованных в 2009-2012 гг. в зарубежных журналах) обобщены представления о путях и механизмах реорганизации геномов на ранних этапах эволюции цианобактерий. Реконструированы схемы филогенетических взаимоотношений одноклеточных и филаментозных таксонов, собраны сведения о роли горизонтального переноса генов и процессов геномной редукции в эволюции симбиотических видов. В рамках разработанной нами концепции об альтернативных направлениях геномной эволюции цианобактерий составлены обновленные таблицы наличия и свойств плазмид и различных мобильных элементов. Разработана оптимизированная схема молекулярно-генетического анализа биоразнообразия природных штаммов цианобактерий и обобщены представления о судьбе паралогичных генов в процессах эволюции цианобактерий. 2. Генетика развития и геномика растений. 2.1. Генетический контроль развития растений. 2.1.1. Изучение ранее полученных мутантов Arabidopsis thaliana с изменениями в морфогенезе показало, что ген ER2 контролирует закономерности роста клеток, определяя их полярность во всех органах растения. Утрата его функции вызывает нарушение роста клеток и оказывает плейотропный эффект на развитие всех органов побега и корня (вызывает утолщение стебля, укорочение листьев, междоузлий, органов цветка, стручков, корня). Функция гена ER2 не связана с регуляцией содержания гиббереллина или чувствительности к этому гормону, являющемуся одним из основных регуляторов растяжения клеток в длину. Не выявлено взаимодействия гена ER2 с генами CLV1, CLV2, CLV3 - негативными регуляторами пролиферации стволовых клеток, нарушение функции которых также приводит к утолщению стебля (в основном за счет фасциации), что подтверждает вывод об участии гена ER2 в иной, чем у генов системы CLV, функции. Исследовано взаимодействие гена ER2 с генами ER1 и LE/DWF5, мутации в которых le и er1, как и мутация er2, изменяют размер клеток. Предполагается, что ген ER1 участвует в контроле пролиферации и поляризации клеток, связанной со структурой цитоскелета и в координации поведения клеток с онтогенетическими сигналами и, по-видимому. участвует в контроле содержания ауксина. У двойных мутантов er1 er2 и le er2 наблюдалось более существенное укорочение линейных размеров всех органов по сравнению с родительскими формами, что свидетельствует о комплементарном взаимодействии гена ER2 как с геном ER1, так и с LE/DWF5 в системе контроля полярности клеток. Поскольку гены LE и ER1 не взаимодействуют между собой, комплементарное взаимодействие обоих генов с геном ER2 может указывать на роль ER2 в интеграции разных гормональных сигналов, возможно путем контроля перестройки цитоскелета под действием разных фитогормонов. Осуществлено картирование гена ER2 на генетической и физической карте нижнего плеча хромосомы 1 с использованием морфологических и ДНК-маркеров (CAPS, или ПЦР-ПДРФ-маркеров). Ген ER2 локализован на генетической карте в положении 126сМ - правее ДНК-маркеров CAPS ADH (на расстоянии 8,7сМ от него) и CAPS G17311(4,2сМ). На физической карте это положение соответствует району 30300 – 30430 тпн (ВАС-клоны Т21F11 и F23A5). Детально изучены особенности морфологии мутанта fas4 с нарушением развития структуры цветоноса, напоминающие изменения, вызванные мутациями в генах FAS и CLV, основной функцией которых является ограничение пула стволовых клеток. У мутанта fas4 обнаружены признаки, ранее не описанные для мутантов clv1, clv2, clv3 и fas1, fas2 (формирование новых осей соцветий в результате разделения всех осей побега, развитие рыльцеподобной ткани на стебле, листья с выростами, напоминающими семяпочки, узкие филаментоподобные лепестки, плодолистикоподобные тычинки). Тесты на аллелизм с мутациями clv1, clv2, clv3 и fas1-1 показали, что мутация fas4 нарушает работу другой системы. Анализ комплекса измененных признаков мутанта позволяет предполагать, что ген FAS4, как и ранее исследованные гены CLV и FAS, ограничивает пролиферацию клеток апикальной меристемы побега, но участвует также в регуляции развития листа и цветка, выполняя важную роль в поддержании целостности апикальной меристемы побега, возможно, блокируя образование новых инициалей меристем (организующих центров и пула стволовых клеток). Показана нестабильность проявления мутации tae, имеющая, по-видимому, эпигенетическую природу. Проверка предположения об эпигенетической природе мутантного фенотипа путем анализа влияния деметилирующего агента 5-азацитидина (5-АЦ) на морфологию мутанта tae показала, что 5-АЦ вызывает задержку цветения растений как дикого типа, так и мутанта, но не не снижает дефекты развития листовой пластинки и образование почек на листьях. Полученные результаты свидетельствует о том, что проявление фенотипических изменений не связано с гиперметилированием ДНК. Поскольку для мутанта tae характерна задержка цветения, было исследовано взаимодействие TAE с геном АР1, который вместе с геном LFY участвует в контроле перехода растений к цветению и развитию флоральной меристемы. При анализе уровня экспрессии гена АР1 в растениях мутанта tae методом ПЦР-РВ показано, что несмотря на задержку зацветания, в едва наметившихся цветоносах мутанта наблюдается более активная экспрессия АР1, чем в растениях дикого типа. Однако по мере его развития уровень экспрессии АР1 в верхушках цветоносов tae снижается и становится в ~ 3 раза ниже, чем в растениях дикого типа. Эти данные указывают на возможное участие гена TAE в поддержания уровня экспрессии АР1 при развитии цветоноса. 2.1.2. Генетический контроль морфогенеза у бобовых. Исследован генетический контроль развития цветка, соцветия и сложного листа у гороха посевного (Pisum sativum L). Установлена роль гена UNI в поддержании пролиферативной активности листа; у мутантов по этому гену происходит преждевременное прекращение роста рахиса листа с образованием листочка. Функция гена TAC-A связана с разделением примордиев, образующихся на оси листа; у мутантов tac-A формируется лист с многочисленными долями единой листовой пластинки. Взаимодействием генов UNI и TAC-A может быть объяснено разнообразие сложных и простых листьев в семействе бобовых. Описано взаимодействие изучаемых мутаций между собой и с другими генами, регулирующими морфогенез листа у гороха, охарактеризовано проявление мутаций на разных стадиях развития. Построена новая схема генетической регуляции морфогенеза листьев различных типов. Получены гибриды от скрещивания мутантов tac-A с маркерными линиями с целью картирования гена TAC-A. Результаты изучения фотосинтетической активности листочков, усиков и структур переходного типа у мутанта tac-A могут быть использованы для описания генетических программ процессов развития и создания новых высокопродуктивных сортов гороха с измененным морфотипом листа. Получены новые количественные данные по онтогенетической динамике и влиянию на продуктивность мутации determinate habit (deh). Проанализирована коллекция мутантов с нарушениями развития цветка и соцветия, у которых в цветке формируются дополнительные плодолистики – fasciata (fa, fas), determinate (det), cochleata (coch) и stamina pistilloida-1 (stp-1). На основе изучения морфогенеза аномальных цветков и обобщения данных филогенетического анализа таксонов с полимерным гинецеем (Swartzia p.p., Archidendron, Affonsea, Acacia p.p. и др.) сформулирована гипотеза о том, что такой гинецей возник из мономерного в результате двух независимых событий – путем слияния цветков в соцветии и за счет гомеозисной замены тычинок. При изучения строения и морфогенеза соцветия у мутантов cochleata получена информация о путях развитии многопестичного состояния. Изучение особенностей симметрии соцветия у мутантов гороха и бобов (terminal inflorescence) показало, что в верхушечном соцветии расположение цветков продолжает филлотаксис вегетативного побега, а при фасциации (увеличение размеров апикальной меристемы) возможен переход к спиральному расположению цветка. 2.1.3. Проведен теоретический анализ имеющихся представлений о стволовых клетках (СК) растений, показаны основные отличия между СК растений и животных и обобщены данные по генетическому контролю признака стволовости клеток побега растений. Показано, что в различия между СК растений и животных базируются на существовании у растений двух особых групп генов. Гены одной группы обуславливают возможность появления СК de novo; гены второй группы контролируют время существования пула СК. С использованием генетических маркеров стволовости установлено существование у растений особых клеток, способных к быстрой трансдифференцировке. Такие клетки могут возникать также из дифференцированных клеток при стрессовых воздействиях. Триггером для этого являются повреждения, которые изменяют содержание гормонов, активируют образование активных радикалов кислорода, перекисей и таким образом запускают генетическую программу образования de novo пула СК. Стрессовые воздействия могут инициировать и образование соматических эмбриоидов. При этом, как и при образовании пула СК почек, между клетками устанавливаются взаимодействия, которые похожи на взаимодействия клеток ниши и СК, причем во всех случаях центральная роль в этих клеточных взаимодействиях принадлежит взаимодействию генов системы WUS – CLV. С использованием метода высокопроизводительного секвенирования осуществлено тонкое генетическое картирование и выделение гена FAS4 арабидопсис, мутация в котором оказывает плейотропный эффект на развитие разных органов растений (лист, стебель, цветки), на пролиферацию апикальной меристемы побега, что вызывает фасциацию стебля и нарушение филлотаксиса. Основная функция гена FAS4 в растениях дикого типа заключается в негативной регуляции пролиферативной активности апикальной меристемы побега. Для картирования гена из популяции F2 от скрещивания мутанта fas4 с линией дикого типа Columbia были собраны пулы растений дикого типа и растений мутантного фенотипа, содержащие по 25 растений. ДНК секвенировали с использованием платформы Illumina HiSeq 2000. Полученные данные обработаны с использованием программы SNPtrack, что позволило локализовать ген в районе 22-23 МБ 5 хромосомы. В этом районе расположен ген TOP1 (At5g55300), мутанты по которому имеют сходный фенотип с fas4. У растений fas4 в этом гене в конце 9 экзона находится стоп-кодон, приводящий к потере С-концевого домена фермента топоизомеразы 1альфа, играющую важнейшую роль в ремоделировании хроматина, контроле процессов метаболизма ДНК, рекомбинации и репарации ДНК. Нарушением функции топоизомеразы ТОР1 объясняется плейотропный эффект мутации на морфогенез разных органов растений арабидопсис. Выраженное эффект мутации на пролиферацию апикальной меристемы обусловлен, по-видимому, тем, что наиболее высокий уровень экспрессии гена ТОР1 наблюдается именно в апикальных частях побега. Исследование взаимодействия гена FAS4/TOP1 с позитивным регулятором стволовости – геном WUS, а также с негативными регуляторами пролиферации апикальной меристемы – генами CLV1, CLV2, CLV3, FAS1 показало, что ген FAS4/TOP1 не взаимодействует с геном WUS, но комплементарно взаимодействует со всеми ранее выявленными негативными регуляторами стволовости. Получены новые данные об участии эпигенетических механизмов в регуляции экспрессивности мутантного полудоминантного аллеля nana (na), обуславливающего раннюю терминацию пула стволовых клеток в апикальной меристеме побега. С помощью анализа проявления мутации na в гетерозиготе на генетическом фоне разных аллелей дикого типа (аллелей рас Columbia, Enkheim, Blanes, Dijon, Wassilewskija и линии Ler) показано, что аллель na обладает свойствами эпиаллелей и проявляет нестабильность – более низкую и варьирующую у разных растений экспрессивность при объединении в гетерозиготе с аллелями дикого типа из разных рас. Предполагается, что снижение экспрессивности аллеля na объясняется тем, что парамутагенные аллели дикого типа рас Columbia и Blanes вызывают частичное замолкание суперэкспрессирующегося парамутабильного аллеля na. 2.2. Изучение скорости молекулярной эволюции единичных и дуплицированных генов классических пероксидаз у Arabidopsis thaliana. Гены классических пероксидаз III класса в процессе эволюции наземных растений многократно дуплицировались и у современных форм покрытосеменных представлены обширными семействами. Среди 73 генов A.thaliana 12 генных пар или триплетов представлены тандемными дупликациями (всего 26 генов), 9 пар (18 генов) представлены сегментными дупликациями. Чтобы сравнить эволюционную динамику однокопийных и дуплицированных генов, проведена оценка уровня несинонимичных (Ka) и синонимичных замен (Ks) и их соотношения (Ka/Ks) между видами A.lyrata и A.thaliana. Показано, что скорость синонимичных замен, Ks, одинакова между тремя группами пероксидазных генов (единичные, тандемно дуплицированные и сегментно дуплицированные), тогда как скорость несинонимичных замен была выше для тандемных дупликаций (Ka = 0,04), по сравнению с сегментными (0,03) и одиночными генами (0,02). Отношение Ka/Ks, характеризующее скорость эволюции генов, также выше для тандемных дупликаций (0,24) по сравнению с одиночными генами (0,12) и сегментно дуплицированными (0,17), что указывает на ослабление действия очищающего отбора на тандемно дуплицированные копии пероксидазных генов. Среди дуплицированных генов A.thaliana выявлены выявлены две группы, отличающиеся по скорости эволюции при сравнении с ортологами из генома A.lyrata. Первая группа (11 дуплицированных пар) характеризовалась сходной с величиной Ka/Ks для обоих генов из дуплицированной пары. Для второй группы (6 пар) характерны 2 – 7 кратные различия между значениями Ka и Ka/Ks для генов дуплицированной пары. Установлено, что такие паралоги существенно различаются и по уровню и специфичности экспрессии. Причем, более высокая скорость эволюции (увеличенное значение Ka/Ks) было характерно для генов с низким уровнем экспрессии. Сравнение паралогичных генов второй группы показало, что эволюционные изменения затрагивали и кодирующие части генов. Высокий уровень Ka/Ks (> 1) выявлен между консервативными гем-связывающими доменами (I и II), в области вариабельного домена, определяющего каталитическую специфичность (variable domain responsible for the catalytic specificity) и некоторых других участках фермента. По-видимому, после дупликации дочерние копии с низким уровнем экспрессии, обусловленной попаданием гена в новое нуклеотидное окружение, могут быстро эволюционировать, что создает условия для появления новых свойств у белкового продукта для субфункционализации дочерней копии гена. 2.3. Генетический контроль устойчивости растений к холоду. 2.3.1. Изучен полиморфизм генов, контролирующих время зацветания у растений природных популяций Arabidopsis thaliana, обитающих в Карелии, на северной границе ареала вида. Исследована последовательность гена FRI у растений A.thaliana из 2-х островных (Радколье и Климецкий) и 4-х континентальных (Кончезеро, Царевичи, Шуйская, Медвежьегорск) популяций Карелии в сравнении с активным аллелем в поздноцветущем экотипе Стокгольм (GenBank № AF228499). В гене FRI обнаружено 11 сайтов с нуклеотидным полиморфизмом (относительно Н51): 5 сайтов находятся в 1-ом экзоне, 4 – в 3 экзоне и 2 – в 1 интроне. Эти изменения не нарушают открытую рамку считывания. Выявлено равномерное распределение полиморфных сайтов. Полиморфизм в позициях 621, 1486, 1971, 2426, 2639, 2669 не приводит к аминокислотным заменам, остальные изменения вызывали несинонимичные замены аминокислот в белке. У растений популяции Медвежьегорск замена А на Т в 736 положении приводит к синтезу Ile вместо Phe. Вероятно это функционально молчащая замена, потому что это две гидрофобные аминокислоты. В результате полиморфизма в 793 позиции в популяциях Шуйская, Кончезеро и Климецкий происходит замена триплета CGC на TGC и кодируемой аминокислоты Сys вместо Arg. Изменение Т-1074 на А ведет к замене Asp на Glu. В результате полиморфизма в 3 экзоне происходит 2 несинонимичные замены. Одна в положении 2200 ведет к замене (положительно заряженного и гидрофильного) Lys на (гидрофобный) Met в двух популяциях (Кончезеро и Шуйская). В позиции 2418 в популяции Кончезеро Pro замещен сходным по свойствам Ala. Популяции Кончезеро и Шуйская обладают высоким сходством нуклеотидных замен. Проведен анализ нуклеотидной последовательности 3’-регуляторной области гена FLC. В этой области локализован промотор антисмыслового транскрипта, который играет важную роль в яровизационно опосредованном эпигенетическом молчании FLC (Heo and Sung, 2011). Во всех карельских популяциях была выявлена вставка двух нуклеотидов относительно последовательности расы Columbia. С использованием метода ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) изучена экспрессия генов FRI, FLC и SOC1 в растениях карельских популяций A.thaliana. В качестве контроля использовали растения раноцветущей расы Dj-M и расы Cvi, которая имеет среднее время цветения (более позднее, чем у расы Dj-M, но более раннее, чем у карельских рас). Результаты показали, что в 2-х недельных проростках выращиваемых в условиях 22-240С уровень экспрессии FRI примерно одинаков у всех исследованных популяций. Уровень экспрессии FLC в рано зацветающих растениях расы Dj-M низкий, что соответствует данным других исследователей, показавшим, что в регуляторной области гена FRI у этой расы может содержаться делеция (около 370 п.н.), которая нарушает функцию гена. У поздно цветущей расы Cvi уровень экспрессии FLC более чем в 2 раза превышал таковой в расе Dj-M, что объясняет более позднее, чем у Dj-M, время зацветания растений расы Cvi. Уровень экспрессии FLC был более высоким у растений всех исследованных карельских популяций не только по сравнению с расой Dj-M, но и по сравнению Cvi. Кратковременное гипотермическое воздействие (40С в течение суток) не приводило к значимым изменениям экспрессии генов FRI и FLC, что, по-видимому, связано с необходимостью более длительной яровизации для перехода на цветение. У растений всех карельских популяций выявлено достоверное снижение уровня экспрессии гена SOC1, который находится под негативным контролем гена FLC. Очевидно, что низкий уровень экспрессии гена SOC1 – результат более высокого уровня экспрессии FLC во всех карельских популяциях. Гипотермическое воздействие приводило к более чем 5-ти-кратному повышению уровня экспрессии SOC1 в растениях расы Dijon-M и 2-3-х – кратному – в карельских популяциях. Поскольку снижения уровня экспрессии FLC при этом не наблюдалось, повышение экспрессии SOC1, по-видимому, обусловлено активацией под действием холода других путей инициации цветения. 2.3.2. Внутривидовой полиморфизм, экспрессия и эволюция генов ICE, контролирующих устойчивость к холоду. Гены Arabidopsis thaliana ICE1 and ICE2 участвуют как в контроле развития устьиц, так и в ответе на холодовой стресс. На основании анализа уровня синонимичных замен (Ks = 0.3407) показано, что сегментная дупликация, которая привела к появлению паралогов, произошла около 10-11 млн лет назад. С помощью филогенетического анализа показано, что ген ICE1 присутствует в геномах как двудольных, так и однодольных растений. Тогда как, ICE2 обнаружен только среди видов Brassicaceae. Сравнительный анализ белков крестоцветных ICE1 и ICE2 показал, что после дупликации структура, функция и регуляция ICE2 начала изменяться по модели субфункционализации. Обнаружена потеря белком ICE2 3-х консервативных мотивов, общих для ICE1, и выявлены новые мотивы, а также потенциальные цис-элементы в промоторной не транслируемой области, которые свидетельствуют о возможном участии ICE2 в защите от биотических стрессовых воздействий. Исследован внутривидовой полиморфизм гена арабидопсис ICE2, играющего ключевую роль в активации генной сети холодостойкости. Исследована последовательность ICE2 из 66 природных рас: 20 южных рас (широта < 43°), 20 рас средних широт (43-51°), 20 рас, произрастающих в условиях северной границы ареала (>50° широты) и 6 уникальных популяций Карелии (> 60° широты). Средний уровень полиморфизма ДНК (Pi) для всех рас имел значение 0,01090. Расы умеренных и южных широт имели сходный уровень этого показателя. В то же время, изменчивость ICE2 у северных экотипов была ниже - 0,00653 и 0,00199 для карельских популяций. Более высокий уровень полиморфизма ДНК гена ICE2 в южных расах сопровождался повышением уровня несинонимичных замен, инсерционно-делеционного полиморфизма, главным образом в 1 экзоне. Уровень дивергенции (отношение Ka/Ks) между полноразмерными последовательностями ICE2 A. thaliana и A. lyrata оказался равным 0,187, в то время как для 1 экзона эта величина составила 0,3127, что указывает на ослабление действия естественного отбора на этот участок гена на межвидовом уровне. Полученные данные свидетельствуют о том, что в разных климатических зонах ген ICE2 подвергается селективному давлению разного уровня. В условиях теплого климата давление очищающего отбора ослаблено, в то время как условиях холодного климата, особенно на границе ареала (Карелия) очищающий отбор приводит к низкому уровню изменчивости гена ICE2. Полученные результаты подтверждают важную роль ICE2 в контроле устойчивости растений арабидопсис к холоду.