Механизмы выживания и гибели клеток человекаНИР

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
4 31 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Механизмы выживания и гибели клеток человека
Результаты этапа: В исследованиях, посвящённых проблеме нанобиобезопасности, показан потенциально токсичный эффект воздействия промышленных углеродных наночастиц (многостенных углеродных нанотрубок и фуллеренов С60) на клетки органов пищеварительной системы при попадании наночастиц в организм экспериментальных животных с питьевой водой. Токсический эффект носит разноплановый характер, но выраженное проявление имеет развитие некротических процессов в энтероцитах кишечника, жировая и гидропическая дистрофии в гепатоцитах печени. При этом воздействие углеродных наночастиц может носить не только прямой, но и опосредованный характер. На клиническом материале, полученном от больных туберкулёзом лёгких, а также на клетках макрофагальной дифференцировки показано, что на экспрессию генов белков- множественной лекарственной устойчивости и их функциональную активность оказывает влияние выраженность туберкулёзного процесса и применение препарата рифампицина. Дополнительно выявлен повреждающий эффект рифампицина на митохондрии, приводящий к развитию окислительного стресса, индукцию апоптоза и, возможно, эпителиально-мезенхимному переходу. Показано, что в популяции альвеолярных макрофагов при прогрессировании туберкулёзного процесса накапливаются макрофаги с дефектами разных стадий фагоцитоза. Применение лёгочного сурфактанта стимулирует процессы фагоцитоза во всей популяции альвеолярных макрофагов, способствуя как инициации, так и завершению фагоцитоза. Установлено, что паклитаксел (антитубулиновый агент, вызывающий гиперполимеризацию микротрубочек и используемый в химеотерапии опухолей), в опухолевых клетках культуры MCF-7 индуцирует возникновение двух групп микроядер, вероятно различных по биогенезу и способу элиминации. Клетки MCF-7 могут элиминировать одиночные микроядра, что может служить защитным механизмом от р53-опосредованного апоптоза. При образовании большого числа микроядер, которые могут быть элиминированы путем «вакуолизации», индуцируется р53-опосредованная гибель клеток. Выявлено, что паклитаксел не вызывает увеличения каннибалического индекса. В его присутствии поглощать и внедряться могут как одноядерные, так и микроядерные клетки. В К-митоз могут вступать как клетка-каннибал, так и поглощенная клетка. Клетки с микроядрами являются более удобной мишенью для внедрения. Внедрение в клетку-каннибала защищает поглощенную клетку от воздействия паклитаксела. При этом его воздействие не влияет на активность лизосомного компартмента поглощенных клеток и не препятствует лизосомной деградации. Как в клетке-каннибале, так и в поглощенной клетке, находящихся в S-периоде, происходит активация кислого везикулярного компартмента. Лизосомы в клетке-каннибале окрашиваются слабее, чем во внедрившейся клетке. По-видимому, нарушение поступления питательных веществ во внедрившеюся клетку активирует в ней лизосомный компартмент. При сокультивировании нормальных клеток с опухолевыми (НаСаТ с А431 и НаСаТ с MCF-7), а также при сокультивировании опухолевых клеток разного происхождения (А431 с MCF-7) наблюдается как гомотипический, так и гетеротипический энтоз. При этом обнаружено, что гомотипический энтоз преобладает над гетеротипическим в каждом из вариантов сокультивирования. Опухолевые клетки различаются по способности вступать в гетеротипические взаимодействия (А431 обладают большей способностью внедряться в другие клетки, чем MCF-7). При гетеротипическом энтозе внедрившаяся клетка подвергается лизосомо-опосредованной деградации (аналогично гомотипическому энтозу). Проведено исследование влияния сукцината витамина Е (СВЕ) на клеточную подвижность культивируемых нормальных кератиноцитов НаСаТ и опухолевых клеток эпидермального происхождения А431. В культуре НаСаТ СВЕ в дозе 60 мкМ вызывает замедление заживления экспериментальной раны за счет подавления подвижности клеток. При более высоких дозах (100 мкМ для НаСаТ) дополнительной причиной ингибирования заживления раны может быть уменьшение площади клеток. Клетки А431 более чувствительны к действию данного агента, по сравнению с НаСаТ. При изучении пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) глаз японских перепелов Coturnix japonica разного возраста (15 и 35 недель), содержащихся в условиях постоянного облучения синим, желтым или естественным светомполучены данные о развитии адаптационно-компенсаторных процессов в клетках РПЭ у молодых (15-недельных) птиц при действии как желтого, так и синего света. В основном затрагивается хондриом клеток: увеличивается содержание митохондрий измененной формы (кольцевидные), обладающих повышенной площадью поверхности. При облучении синим светом эти процессы, видимо, более выражены и проявляются также в изменении фагоцитарной способности клеток. Облучение 35-недельных птиц синим светом, по сравнению с желтым, приводит к снижению относительного содержания митохондрий измененной формы и миелоидных телец. Далее установлено, что оксикаротиноидная диета у птиц 15-недельного возраста, по сравнению со стандартным кормом, приводит к увеличению на 20% относительного содержания митохондрий в клетках РПЭ. Проведен ультраструктурный анализ изменений РПЭ людей разного возраста: 20, 40 и 85 лет. Из полученных данных следует, что наиболее сходными субклеточными маркерами старения клеток РПЭ человека и японского перепела является накопление липофусциновых гранул (в том числе, меланолипофусцина) и изменение структуры ядра. При морфометрическом анализе на светооптическом уровне слоев РПЭ глазных бокалов перепелов разного возраста установлено линейное увеличение средней площади клеток с возрастом, что указывает на развитие их гипертрофии. При сравнительном анализе ультраструктуры кардиомиоцитов правого желудочка японских перепелов разных возрастов установлено снижение соотношения удельных долей миофибрилл и митохондрий. Этот показатель может считаться общим внутриклеточным маркером старения для миокарда разных отделов сердца птиц и млекопитающих, так как аналогичное снижение выявлено ранее в кардиомиоцитах левого желудочка перепела и мыши. Универсальными внутриклеточными маркерами старения миокарда и сетчатки можно считать изменение формы митохондрий (удлинение в левом желудочке, появление кольцевидных – в правом желудочке и сетчатке) и накопление липофусцина. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Клеточный каннибализм, ультраструктура, углеродные наночастицы, множественная лекарственная устойчивость, опухолевые клетки, клеточный каннибализм, лизосомы, фагоцитоз, туберкулез, витамин Е, рифампицин, сетчатка, старение, фотооблучение, оксикаротиноиды, миокард, кардиомиоциты, митохондрии
5 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Механизмы выживания и гибели клеток человека
Результаты этапа: 1. Энтоз является одним из вариантов клеточного каннибализма, при котором клетка внедряется в другую клетку и, как правило, погибает внутри последней. В настоящей работе на субстратзависимой культуре нормальных кератиноцитов человека НаСаТ исследованы изменения морфологии обеих клеток-участниц энтоза на протяжении всего процесса. С помощью совмещения световой и сканирующей электронной микроскопии показано, что одна клетка полностью окружена плазматической мембраной другой клетки. Методами цитохимического и иммуноцитохимического окрашивания выявлены изменения локализации и формы ядра наружной клетки, деградация ядра внутренней клетки, постепенное разрушение клеточных контактов между клетками-участницами энтоза, неоднократное перемещение мембранных органелл (аппарата Гольджи, лизосом, митохондрий и аутофагосом) наружной клетки, перестройка ее цитоскелета, а также изменение состояния лизосом, аутофагосом и митохондрий в обеих клетках-участницах. Основываясь на этих данных, мы разделили энтоз на пять стадий, что в дальнейшем позволит систематизировать описание данного варианта клеточной гибели. 2. С целью исследования судьбы клеток, погибающих по типу энтоза, проведено прижизненное исследование процесса энтоза в клетках культуры А431 и МСF7 с использованием программного обеспечения Vision Bio. Обнаружены различные варианты поведения внедрившейся и энтозной клеток. Внедрившаяся клетка может находиться внутри энтозной вакуоли длительное время и деградировать, может покинуть энтозную вакуоль или поделиться внутри этой вакуоли. В некоторых случаях энтозная клетка может вступить в апоптоз или после выхода внедрившейся клетки - в митоз. Морфометрический анализ показал, что площадь и периметр энтозной вакуоли постепенно уменьшается, изменение формы поглощенной клетки коррелирует с изменением формы энтозной вакуоли. Полученные результаты показывают разнообразие возможных завершений энтоза. 3. Для решения проблемы взаимосвязи между микроядерностью и жизнеспособностью опухолевых клеток проведено исследование механизмов деградации микроядер в клетках культуры MCF7. Образование микроядер в клетках культуры MCF7 индуцировали противоопухолевым препаратом паклитакселом с последующим удалением агента. В клетках культуры МСF-7 выявлены два морфологически различных типа микроядер. Для одиночных микроядер возможна лизосомная деградация, для множественных характерна «вакуолизация» за счет нарушения организации ядерной оболочки. Микроядерность сопровождается нарушением организации хроматина. Это в свою очередь вызывает перемещение индуктора апоптотической гибели белка р53 в некоторые микроядра, не зависимо от их размера, оптической плотности, вакуолизации. Полученные данные показывают неоднородность популяции микроядер по морфологическим и функциональным критериям, а также по способу элиминации. В дальнейшем выяснение характера взаимосвязи между этими параметрами, ответит на вопрос как влияет микроядерность на жизнеспособность опухолевых клеток. 4. Для решения проблемы биобезопасности углеродосодержащих наночастиц исследована способность многостенных углеродных нанотрубок к биодеградации. Анализировали возможность биодеградации наноматериала под влиянием внеклеточного (в желудочно-кишечном тракте) и внутриклеточного (внутри фагоцитов) пищеварения. В работе использовали МУНТ в составе промышленного материала «Таунит». В качестве пищеварительных агентов были использованы соляная кислота, желудочный сок мышей, гипохлорит натрия и перекись водорода с ионами железа и без. Методами трансмиссионной и аналитической электронной микроскопии.обнаружено, что в присутствии различных активных веществ морфологическая структура углеродного наноматериала может разрушаться. Тем не менее, картины дифракционного рассеяния электронов указывают на сохранение кристаллической структуры в измененных МУНТ, что позволяет говорить о принципиальной невозможности их деградации до биологически безопасных продуктов. Таким образом, патологические эффекты МУНТ не смогут быть полностью нивелированы за счет разрушения отдельных нанотрубок. 5. Для сравнительного исследования характера воздействия наноформ и стандартного пртивотуберкулёзного препарата рифампицина на клетки человека и бактериальные клетки изучено его цитотоксическоое действие на макрофагальные клетки человека и на микобактерии туберкулёза штамма БЦЖ. Препарат нанорифампицин создан в НИИ молекулярной медицины, Россия. Показано, что под действием нанорифампицина в макрофагальных клетках могут происходить изменения в структуре хондриома, связанные с формированием в околоядерной области «компактного центра» митохондрий. Гибель небольшой популяции макрофагальных клеток идёт по митохондриальному пути апоптоза. Наноформа препарата оказалась значительно менее токсичной для клеток человека моноцитарно-макрофагального ряда, по сравнению с традиционной формой рифампицина. Обнаружено, что нанорифампицин влияет на функциональную активность белка лекарственной устойчивости Pgp. Это свидетельствует о его способности к связыванию с данным белком и возможности формирования устойчивости к рифампицину. Действие нанорифампицина является более выраженным, чем рифампицина и PLA в отдельности, что указывает на синергизм действия компонентов нанопрепарата. Показано, что нанорифампицин активен прежде всего против внутриклеточных форм микобактерий БЦЖ. Полученные результаты свидетельствуют о многофакторности действия нанорифампицина на клетки макрофагального ряда. В тоже время отсутствие выраженной токсичности препарата и его эффективность против внутриклеточных форм микобактерий свидетельствуют о перспективности направления наномедицины, связанного с разработкой и созданием наноформ уже зарекомендовавших себя в клинической практике противотуберкулёзных препаратов. 6. С целью выяснения процессов старения кровеносной сосудистой системы глаза проведен морфометрический анализ на световом и электронномикроскопическом уровне собственной сосудистой оболочки (ССО) глаз японских перепелов Coturnix japonica разных возрастных групп. Обнаружено, что изменения в ССО японского перепела сходны с описанными возрастными изменениями ССО человека. Это указывает на целесообразность использования японских перепелов в качестве модельных объектов для изучения процессов старения сосудистой системы глаза человека. Проведен морфометрический анализ с использованием световой и электронной микроскопии ПЭС и ССО глаз японских перепелов разного возраста, содержащихся в условиях постоянного облучения синим, желтым или естественным (белым) светом. Установлено, что: а) облучение птиц желтым светом не вызывает существенных изменений структуры ПЭС, по сравнению с естественным освещением; ряд выявленных изменений может указывать на ускоренное развитие некоторых признаков старения клеток ПЭС у птиц старшей возрастной группы при повседневном синем освещении; б) при повседневном облучении перепелов синим светом происходят изменения ССО, затрагивающие в основном малые кровеносные сосуды и различающиеся у птиц разного возраста. Во всех возрастных группах наблюдается тенденция к увеличению капиллярно-сосудистого соотношения. Для выяснения реакции ССО на кратковременное сильное воздействие синего света проведен морфометрический анализ ССО японских перепелов разного возраста при 40-минутном облучении глаза ярким синим светодиодом. Полученные данные указывают на возможное снижение скорости лимфо- и кровотока в хориоидее при облучении, особенно выраженное у птиц старшей возрастной группы. Это может негативно сказаться на функциональном состоянии клеток сетчатки. 7. С целью поиска универсальных маркеров старения для тканей разных органов на электронно-микроскопическом уровне проведен сравнительный анализ кардиомиоцитов правого предсердия самок японского перепела Coturnix japonica разных возрастных групп. Обнаружено, что возрастные изменения проявляются неодинаково в разных отделах сердца. Проведено сопоставление этих изменений с теми, что обнаружены в сетчатке японского перепела. В результате можно заключить, что универсальными внутриклеточными маркерами кардиомиоцитов разных отделов сердца и сетчатки можно считать изменения формы митохондрий (удлинение в левом желудочке и правом предсердии, кольцевидные – в правом отделе сердца и сетчатке) и накопление гранул липофусцина (в правом предсердии, правом желудочке и сетчатке).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".