ИСТИНА

Наличие информации о полностью секверованных геномах модельного растения Arabidopsis thaliana и цианобактерии Synechocystis позволяет исследовать проблемы структурной и функциональной геномики фотосинтезирующих организмов. Крупномасштабной задачей, над решением которой работают во многих странах, является идентификация функций ВСЕХ генов и внегенных элементов у этих объектов. Проведенные коллективом научной школы исследования открыли новые направления в изучении генетического контроля процессов морфогенеза растений, механизмов развития резистентности к стрессовым факторам, роли геномного полиморфизма в изменчивости и эволюции. Созданные в лаборатории уникальные коллекции мутантов арабидопсис, гороха и цианобактерий являются основой для поиска, клонирования, идентификации новых генов, участвующих в генно-метаболических сетях, характерных для фотосинтезирующих организмов. Большое внимание будет уделено молекулярно-генетическому анализу регуляторных генов, контролирующих координацию процессов развития и адаптации клеток в стрессовых условиях среды. Сведения о структурно-функциональной организации геномов имеют практическое значение для разработки методов селекции и генной инженерии фототрофных организмов, получения нового типа биотехнологически перспективных продуцентов ферментов, биологически активных соединений, молекулярного фотоводорода.

I. Структурно-функциональное изучение геномов цианобактерий. 1.1. Проведено изучение генетического контроля и молекулярных механизмов поглощения ионов железа в клетках цианобактерии, которые нуждаются в ионах железа в качестве кофакторов фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортных цепей. Дефицит ионов железа является для цианобактерий стрессовым фактором. У цианобактерии Synechocystis 6803 АВС-транспортер, кодируемый генами futA1, futA2, futB и futC, является основной и пока единственной экспериментально подтвержденной системой транспорта ионов железа. При этом еще 14 генов, составляющих в геноме Synechocystis 6803 один кластер вместе с 3 генами транскрипционных регуляторов семейства AraC/XylS (pcrR, pchR1 и pchR2), кодируют компоненты предполагаемых транспортеров сидерофоров (высокоаффинные системы транспорта ионов железа). В нашей работе проведено молекулярно-генетическое изучение процессов адаптации клеток Synechocystis 6803 к дефициту железа на уровне изменений содержания пигментов и экспрессии генов, кодирующих компоненты систем транспорта ионов железа. У двух штаммов дикого типа различного происхождения (DT-М и DT-J) выявлена генетически обусловленная дифференциация специфических адаптивных реакций на дефицит ионов железа. В стрессовых условиях штамм DT -М отличался ранним хлорозом (адаптивная деградация фикобилинов), тогда как штамм DT -J характеризовался повышенным уровнем адаптивной индукции генов основной FutАВС-системы транспорта ионов железа. Вместе с тем оба штамма в ответ на голодание по железу (42 ч) демонстрировали сходный уровень индукции гена isiA (в 200-300 раз), продукт которого, предохраняет клеточные структуры от фотоокисления, образуя комплекс с фотосистемой I в стрессовых условиях. Эти данные свидетельствуют о том, что у штамма ДТ-J повышение активности транспортера FutАВС предотвращает декомпозицию светособирающего антенного комплекса и тем самым способствует нормальному функционированию фотосистемы II на раннем этапе голодания клеток по железу. В результате анализа с помощью ОТ-ПЦР структурной организации кластера, включающего 14 генов, кодирующих компоненты предполагаемых систем транспорта сидерофоров (fecC, fecD, fecE, fecB1, iutA, fecB2, fhuA1, fhuA2, exbD, exbB, tonB, fhuA3, fecB3, fecB4), 3 регуляторных гена (pcrR, pchR1, pchR2), а также гены с неизвестной функцией (sll1203, sll1204, sll1407), показано наличие 2 оперонов: fecE-fecB1 и exbB-exbD-fhuA2. Установлено, что экспрессия 3 регуляторных генов, pcrR, pchR1 и pchR2, 3 структурных генов, fhuA1, fhuA3 и sll1407, а также оперонов fecE-fecB1 и exbB-exbD-fhuA2 индуцируется дефицитом ионов железа. Экспрессия 4 генов fecC, fecD, iutA и tonB не зависит от наличия ионов железа в среде. Сравнительный анализ штамма DT-М и мутантов с инсерционной инактивацией регуляторных генов pcrR и pchR2 показал, что опероны fecE-fecB1 и exbB-exbD-fhuA2, гены pchR2, fhuA1, fhuA3 и sll1407, гены основной системы транспорта ионов железа futC и стрессового ответа isiA входят в состав pcrR-регулона, негативно регулируемого геном pcrR. На основании полученных результатов предложена схема pcrR-зависимой регуляции экспрессии генов гомеостаза ионов железа у Synechocystis 6803. Согласно этой схеме ген pcrR негативно контролирует экспрессию не только генов своего кластера, кодирующих компоненты предполагаемых высокоаффинных транспортеров, но и ген основной системы транспорта ионов железа futC, а также ген стрессового ответа isiA, которые в совокупности образуют pcrR-регулон. Структурные гены изучаемого кластера кодируют белки-гомологи бактериальных систем, которые связывают и транспортируют в клетку известные железосодержащие субстраты. По критерию гомологии продукты генов iutA и fhuA у Synechocystis 6803 могут служить рецепторами аэробактина и феррихрома. Задачей последующих исследований является функциональный анализ роли регуляторных генов pchR1 и pchR2 в контроле транспорта ионов железа при продолжительном голодании клеток, а также функциональный анализ структурных генов кластера с целью идентификации железосодержащих субстратов, поглощаемых цианобактериями. 1.2. Обобщены литературные и собственные данные по основным системам регуляции экспрессии генов у цианобактерий в ответ на стрессовые воздействия - низкие и высокие температуры, солевой, гиперосмотический, окислительный стресс, дефицит микроэлементов, свет высокой интенсивности. В результате систематизированы современные знания о генетическом контроле и молекулярных механизмах защиты клеток цианобактерий при стрессовых воздействиях. Представлена функциональная характеристика известных двухкомпонентных систем регуляции с участием серин-треониновых протеинкиназ эукариотического типа, σ-субъединиц РНК-полимеразы, ДНК-связывающих транскрипционных факторов. На основании биоинформатического анализа доменной архитектуры белков, кодируемых генами Synechocystis, идентифицированы и классифицированы все потенциальные транскрипционные факторы этой цианобактерии. Проанализированы различные механизмы восприятия стрессовых сигналов, включая систему регуляции степени сверхспирализации ДНК при различных стрессовых воздействиях. 1.3. Исследована функциональная роль генов, кодирующих серин/треониновые протеинкиназы в регуляции адаптивных ответов клеток цианобактерий на тепловой стресс. Создана коллекция мутантов Synechocystis 6803 с инсерционной инактивацией 11 spk-генов. Разработана методика, позволяющая дифференцировать белки, фофорилированные по гистидину (His) и по серину/треонину (Ser/Thr). Установлено, что кратковременный тепловой стресс не влияет на состав растворимых белков, но влияет на уровень Ser/Thr-фосфорилирования индивидуальных белков. С помощью МАЛДИ-ТОФ масс-спектрометрии идентифицирован ряд цитоплазматических белков, (в частности, шапероны теплового стресса, GrpE и GroES), которые являются возможными мишенями Ser/Thr-фосфорилирования. Таким образом, впервые показано (совместно с партнерами из Института физиологии растений и Института фундаментальной биологии, Оказаки, Япония), что серин/треониновые белки SpK C/F/K играют регуляторную роль в передаче сигналов через фосфорилирование белков теплового шока. 1.4. На основе анализа in silico секвенированных геномов 45 видов и штаммов цианобактерий обобщены сведения о наличии, количестве и распределении мобильных элементов (МГЭ), включающих IS-последовательности, MITE-элементы, интроны группы II у 8 таксономических групп цианобактерий. Выявлена позитивная корреляция между размерами геномов и количеством генов транспозаз, контролирующих перемещение МГЭ и геномные перестройки. У филаментозных цианобактерий обнаружено большое число различного типа МГЭ, вовлеченных в регуляцию процессов клеточной дифференциации и компартментализации функций. Исключением из почти линейной корреляции между величиной геномов и числом МГЭ являются одноклеточные виды Microcystis и Crocosphaera watsonii, у которых МГЭ составляют более 10% генома. Выдвинуто предположение о том, что у этих видов геномная эволюция шла преимущественно за счет транспозиционных геномных перестроек в отличие от морских одноклеточных бактерий Synechococcus и Prochlorococcus, у которых отсутствуют МГЭ и процессы эволюции связаны с мутационной изменчивостью, о чем свидетельствует высокий уровень генного полиморфизма. Таким образом, обобщены сведения о важной роли генетических мобильных элементов в эволюции цианобактерий и сформулированы представления об альтернативных сценариях геномной эволюции у различных филогрупп этих фототрофных прокариот. Рассмотрена роль цианофагов в горизонтальном переносе генов и геномной и экологической диверсификации у цианобактерий. Суммированы данные о переносе генов аппарата фотосинтеза, светозащитных белков и ряда метаболических процессов (более 20 генов цианобактерий) в составе цианофагов различных групп. Изложены представления о связи явлений лизогении с динамикой микроэволюционных процессов в различных экологических и сезонно-климатических условиях. Высказано предположение о том, что вирусные гены цианобактериального происхождения могли приобретаться независимо, многократно и в разные периоды эволюционной истории цианобактерий. Таким образом, на основании анализа молекулярно-генетических сведений о геномах циановирусов и цианобактерий подтверждена концепция, согласно которой коэволюция геномов циановирусов и их хозяев является одним из ключевых факторов микроэволюционных процессов в цианобактериальных экосистемах. 2. Генетический контроль и молекулярные механизмы процессов морфогенеза у растений. 2.1. Осуществлено картирование и секвенирование гена LEPIDIUM-LIKE (LEL), контролирующего формирование лепестков и тычинок у Arabidopsis thaliana. В ходе исследования проанализировано 860 растений по 3 молекулярным маркерам. Показано, что в гене LEL присутствуют F-бокс и WD40-повторы, что свидетельствует о принадлежности белка к транскрипционным факторам. При секвенировании кДНК гена у мутанта lel установлено, что мутация вызвана делецией четырех нуклеотидов (с 254 по 257 нуклеотид кДНК), что приводит к возникновению стоп кодона после 96 аминокислоты, при нормальной длине белка в 445. Для выяснении фуекции гена LEL в сети генетической регуляции развития цветка методом количественной ПЦР продуктов обратной транскрипции с детекцией результатов в реальном времени (количественная РВ ОТ-ПЦР/quantitative Real-Time RT-PCR) проведен сравнительный анализ экспрессии ряда генов у мутанта lel и растений дикого типа. Проанализирована экспрессия 26 генов 3-х групп: 10 генов контролирующих инициацию цветения и развитие цветка, 9 генов контролирующих меристематическую активность меристемы побега и 7 генов, ответственных за меристематическую активность листовых меристем. Установлено, что мутация lel влияет только на экспрессию гена WUSCHEL – центрального гена, контролирующего меристематическую активность меристемы побега: снижает его активность более чем в 10 раз. Таким образом, впервые установлено, что ген LEL является ключевым позитивным регулятором гена WUSCHEL на стадии формирования цветка. Исследовано взаимодействие гена LEL с гомеозисными генами, контролирующими развитие цветка (AP1, AP2, AP3) путем анализа фенотипа двойных мутантов. Установлено, что ген LEL не взаимодействует с генами АР1, АР2 и АР3, и изменение типа органов в 1,2 и 3 мутовках цветка у гомеозисных мутантов ар11-20, ар2-1, ар2-14, ар3-1 не приводит к восстановлению числа органов 2 и 3 мутовок у мутанта lel. Эти данные свидетельствуют о том, что определение числа органов в срединной (медиальной) зоне цветка мутанта lel не зависит от активности гомеозисных генов, определяющих тип органов в каждой из мутовок. Анализ фенотипа двойного мутанта lel clv1-1 не выявил взаимодействия гена LEL с геном CLV1: у двойного мутанта lel clv1-1 наблюдали ту же редукцию лепестков и тычинок, что и у одиночного мутанта lel, но увеличение числа плодолистиков, как у мутанта clv1-1. Отсутствие взаимодействия между двумя генами, контролирующими пул стволовых клеток свидетельствует о независимой регуляции его размера/времени жизни в разных зонах флоральной меристемы. Ген CLV1 вместе с CLV2 и CLV3 ограничивают пролиферацию стволовых клеток главным образом в центральной зоне флоральной меристемы, а ген LEL поддерживает клеточную пролиферацию, по-видимому, только в медианной зоне. 2.2. Разработана методика использования количественной полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции для анализа изменений в структуре и функционировании генетических сетей у разных видов в целях изучения проблем морфологической эволюции. Для этого: 1) Произведено определение последовательностей генов крестоцветных (Lepidium sativum, Matthiola longipetala subsp. bicornis, Alyssum tortuosum, Iberis amara), гомологичных стабильно экспрессирующимся однокопийным генам Arabidopsis thaliana: At1g27450, At5g08290, At5g60390, At5g25760, At3g11150, At4g33380, At5g46630 и At4g34270. 2) С использованием проб кДНК из листьев, соцветий и цветков анализировали устойчивость экспрессии этих генов. Комплексный анализ данных по 5 видам и разным органам показал, что наиболее стабильная экспрессия наблюдается у ортологов генов At4g34270, At5g46630 и At4g33380. В итоге установлено, что для определения изменений в структуре и функционировании генетических сетей методом количественного Real-Time RT-PCR – анализа у разных видов в качестве контрольных/референсных наиболее целесообразно использовать гены At4g34270, At5g46630 и At4g33380. 2.3. Изучение полиморфизма числа, положения и типа органов в цветках может служить ключом к пониманию механизмов лежащих в основе их разнообразия. Проведен анализ числа и положения органов в цветках дикого типа и у ряда мутантов у Arabidopsis thaliana c нарушением в расположении органов цветка (lel, ap2-1, clv1-1 и др.) с использованием световой и электронной микроскопии. Полиморфизм, присущий разным генотипам анализировали с использованием индивидуальных диаграмм на основе которых созданы обобщенные диаграммы, отражающие полиморфизм по числу и положению органов. Показано, что в цветках дикого типа и мутантов A. thaliana положение лепестков зависит от положения чашелистиков, а тычинок от плодолистиков, но положение плодолистиков не зависит от числа и положения органов в серединной зоне цветка – лепестков и тычинок. При сильном уменьшении числа органов проявляется зависимость органов апикальной части от положения органов в базальной части цветка. Это свидетельствует о том, что положение органов в апикальной части цветка определяется до определения положения органов в серединной зоне цветка. Только после этого идет насыщение цветка органами в серединной зоне цветка, что вероятно связано с особенностями динамики функционирования меристемы. Эти данные являются экспериментальным подтверждением предсказаний созданной ранее динамической математической модели развития цветка арабидопсис (Чуб, Пенин, 2004; Алексеев и др., 2005; Скрябин и др., 2006). 2.4. У цветковых растений наблюдается большое разнообразие структуры цветка и соцветия. Однако механизмы, лежащие в основе этого разнообразия, до сих пор остаются не до конца изученными. Одним из методов изучения наблюдаемого разнообразия является метод математического моделирования, основанный на создании имитационных моделей, базирующихся на данных о генетическом контроле развития. Полученные модели используют для проведения компьютерных экспериментов, направленных на определение тех изменений в функционировании генетической сети, которые могут приводить к наблюдаемым изменениям морфологических структур, свойственных различным таксонам. С помощью метода математического моделирования изучены возможные изменения в генетической сети, регулирующей развитие соцветия и цветка, определяющей наличие или отсутствие терминального цветка. Для создания модели, часть генов была сгруппирована в несколько функциональных классов: отвечающих за переход к цветению, поддержание пролиферативной активности меристем и др. Получено шесть дифференциальных уравнений описывающих взаимодействие выделенных классов генов. Численное решение этих уравнений позволило определить возможность прекращения пролиферативной активности меристемы соцветия при образовании цветка, а также время, за которое она происходит, в зависимости от динамики функционирования генной сети. Точные значения эмпирических коэффициентов в уравнениях подбирались так, чтобы соотношение времен терминализации, полученных при различных состояниях генетической сети, соответствовало соотношению времен терминализации, полученному в эксперименте. Анализ модели показал, что переход между открытым и закрытым типами соцветия может происходить не только при изменении функционирования генов, отвечающих за переход к цветению, но и генов флорального морфогенеза, прямо или опосредованно контролирующих терминацию развития меристемы. Второй вариант перехода связан прежде всего с неравномерностью активации генов приводящих к терминации. Полученные данные свидетельствуют о том, что переход между типами соцветий может быть обусловлен различными (не ортологичными) изменениями в сети генетической регуляции развития соцветия. 2.5. Выявлена новая группа генов, определяющих время и место экспрессии генов стволовости. Установлен рецессивный моногенный характер наследования мутаций арабидопсис er2, fip1, fas4 и показано отсутствие аллелизма с другими мутациями, вызывающими похожие изменения фенотипа; доказана неаллельность мутаций er2 и er1, fas4 и fas1, fip1 и as1, fip1 и as2. Исследование мутантов c использованием световой и электронной микроскопии показало, что мутация er2 изменяет соотношение пулов клеток центральной и периферической зон в апикальной меристеме побега, и блокирует растяжение клеток во всех исследованных органах (листья, стебель, органы цветка, плоды), линейно укорачивая все вегетативные и репродуктивные органы. Мутация fas4 вызывает нарушение механизмов поддержания стабильного размера пула апикальной меристемы побега. Многократно в процессе роста растения наблюдается увеличение ее пула, что приводит к фасциации побега и его расщеплению. У мутантов fas4 выявлено также влияние на детерминацию типа органов 2-ой мутовки. Выяснена роль гена FIP1 в контроле пролиферации клеток листовой и флоральной меристем путем анализа особенностей проявления рецессивной мутации fip1 в развитии растений арабидопсис. У мутанта нарушена пролиферация клеток органов цветка (главным образом, чашелистиков и лепестков) и, в меньшей степени, листа. В дистальной области этих органов наблюдается появление групп очень крупных клеток, которые по предварительным данным стационарной ДНК-цитометрии характеризуются высоким уровнем плоидности. Эти данные свидетельствуют об участии гена FIP1 в контроле эндоредупликации. С помощью анализа фенотипа двойного мутанта fip1 as1 выявлено комплементарное взаимодействие гена FIP1 с геном AS1 – негативным регулятором экспрессии гомеобоксных генов KNAT1,2 6, поддерживающих недетерминированное состояние клеток апикальной и флоральной меристем. Выявлены различия проявления fip1 и as1 в лист и цветке (мутации as1 нарушают главным образом развитие листа, а мутации fip1 – органов цветка), что свидетельствует о специфичности действия генов AS1 и FIP1 в контроле пролиферации клеток. С использованием морфологических маркеров осуществлено картирование генов FIP1 и ER2 в хромосоме 1 A.thaliana Показано, что ген FIP1 сцеплен с геном AN, локализованным в верхнем плече хромосомы 1, а ген ER2 - с генами CLV1 и GL2, локализованными в нижнем плече той же хромосомы. 2.6. Разработана модель анализа влияния зависимых от температуры градиентов ауксина на процессы морфогенеза растений. Впервые с использованием трансгена DR5::GUS (репортерныйй ген бета-глюкуронидазы под контролем синтетического чувствительного к ауксину промотора) проведено изучение распределения активного ауксина в растениях мутанта abr, имеющего температурозависимое нарушение экспрессии гена ABR/PID, играющего первостепенную роль в контроле полярного транспорта ауксина. Установлено, что путем изменения температуры выращивания растений можно существенно менять характер распределения и содержание активного ауксина в цветке и листе. В отличие от растений дикого типа, которые при перенесении из оптимальной для арабидопсис в условия повышенной температуры показывали снижение содержания активного ауксина, растения мутанта накапливали ауксин в листьях и цветке. Таким образом доказано, что ген abr участвует в контроле процессов морфогенеза путем создания градиентов ауксина. Для доказательства эффективности данной модели созданы и исследованы гомозиготные линии двойных мутантов abr ap1-1 и abr ap2-1, линия гомозиготного мутанта abr с эктопической экспрессией гена АР1 (abr 35S::AP1), а также линия с мутацией abr и трансгеном AP1::GUS в гомозиготе (репортерный ген β-глюкуронидазы под контролем промотора гена АР1). Исследование этих линий выявило взаимодействие гомеозисных генов АР1 и АР2 с геном ABR/PID. Установлено, что при определении времени перехода на репродуктивную стадию и идентичности флоральной меристемы ген ABR/PID взаимодействует с геном АР1 по типу доминантного эпистаза. Из данных об увеличении уровня транскрипции гена АР1 в растениях мутанта abr и расширении зон транскрипции в листьях и внутренних мутовках цветка (результаты анализа экспрессии трансгена АР1::GUS) следует, что, контролируя распределение ауксина в тканях, ген ABR/PID участвует в ограничении уровня и пространства транскрипции АР1. С использованием аллелей ap1-20, ар1-3, ар1-6 и ap1-1 с нарушениями разных функциональных доментов транскрипционного фактора АР1 из семейства MIKC-белков получены новые данные, свидетельствующие о том, что С-домен белка АР1 предотвращает нарушение детерминации типа репродуктивных органов при эктопической экспрессии гена АР1 во внутренних мутовках цветка мутанта abr. 2.7. Изучен характер взаимодействия гена ABR/PID с геном AGAMOUS (AG) - негативным регулятором пролиферации стволовых клеток в меристеме цветка Arabidopsis thaliana. Существенное усиление пролиферации клеток флоральной меристемы по сравнению с родительскими формами и образование ветвящихся побегоподобных цветков у двойного мутанта abr ag-1 свидетельствует о комплементарном взаимодействии генов AG и ABR/PID. Эти данные указывают на то, что ген ABR/PID вместе с геном AG участвует в ограничении пролиферации стволовых клеток меристемы цветка. В цветках мутанта abr методом количественного Real-Time RT-PCR - анализа выявлено 3-х-кратное повышение уровня транскрипции гена WUS. Этот факт вместе с установленным нами нарушением распределения ауксина в растениях мутанта abr, позволяет предполагать, что ген PID/ABR, контролируя транспорт ауксина, участвует в определении доменов экспрессии гена WUS. Таким образом, комплементарное взаимодействие генов AG и ABR/PID основано на их совместном влиянии на экспрессию гена WUS, контролирующего поддержание пула стволовых клеток: ген AG определяет уровень, а ген ABR/PID – место экспрессии WUS в меристеме цветка. Изучено взаимодействие гена PID/ABR с генами AP3 и PI, контролирующими развитие лепестков и тычинок (гомеозисные гены В-класса). У двойных мутантов abr pi-1 и abr ap3-1 обнаружено изменение типа органов в III мутовке по сравнению с родительскими формами. Вместо тычинок, которые образовывались у abr, а также тычинок и тычинко-плодолистиков, которые образовывались у мутантов ap3-1 и pi-1, у двойных мутантов образовывались филаменты или филаменты с рыльцевой тканью. Влияние мутации abr на экспрессивность мутаций ар3-1 и pi-1 свидетельствует о том, что ген ABR участвует в контроле развития тычинок вместе с генами AP3 и PI. 2.8. Изучено взаимодействие гена NA генами негативной регуляции стволовости. Доминантная мутация na вызывает нарушение поддержания пула меристематических клеток в апикальной меристеме побега арабидопсис, что является отличительной особенностью трансгенных растений с эктопической экспрессией генов CLV. Для выяснения взаимодействия гена NA с генами CLV1,2,3 созданы и исследованы двойные мутанты na clv1, na clv2 и na clv3. Доминантная мутация na влияла на проявление мутаций clv1,2,3, что свидетельствует об участии этих генов в контроле последовательных этапов морфогенетического процесса. Для маркирования транспозоном гена na проведены скрещивания гетерозигот с трансгенными линиями арабидопсис, содержащими транспозоны кукурузы Ac и Ds. Ac-элемент в составе используемой конструкции содержит ген транспозазы и маркирован генами устойчивости к канамицину NPT и Lc (ген кукурузы, обуславливающий высокую опушенность листа) под контролем промотора 35S. Ds-элемент содержит маркерный ген BAR (устойчивость к гербициду фосфинотрицину – BASTA) под промотором гена nos. В F1, F2 и F3 поколениях проведен отбор растений с доминантным фенотипом na и признаками устойчивости к канамицину, гербициду BASTA (маркер присутствия транспозона Ds) и сильной опушенности листьев. Для оценки перспектив использования транспозона Ds в маркировании гена na и его последующем клонировании проведен анализ локализации Ds относительно гена na с использованием признака устойчивости к канамицину (Km) в качестве маркера локализации Ds. Для анализа использовали семена F3 -поколения, собранные с растений из F2, проявляющих гетерозиготность по мутации na. Расщепление по устойчивости к Km в семьях F3 позволило показать, что сайт инсерции вектора на основе Ds-элемента локализован в первой хромосоме на расстоянии 2,7 сМ от мутантной аллели na. Таким образом, удалось найти рекомбинантную линию, где доминантная мутация na находится в цис-положении в тесном сцеплении с элементом Ds, что говорит о перспективности дальнейшей работы с этой линией. Данные о положении сайта инсерции вектора на основе Ds-элемента в исследованной линии говорят о возможности использования этой линии для получения мутаций по другим генам, локализованным в начале верхнего плеча первой хромосомы. 2.9. Исследованы особенности генетического контроля активности апикальной меристемы побега у гороха посевного (Pisum sativum L.). Описано плейотропное проявление мутации в гене DETERMINATE HABIT (DEH), приводящей к редукции прилистников и листьев в репродуктивной зоне и раннему прекращению пролиферации апикальной меристемы. Исследованы механизмы развития пазушного цветоноса и кроющего листа в соцветии мутантов determinate (det) с нарушениями дифференцировки апикальной меристемы побега. Пазушное соцветие приобретает признаки цветка, а кроющий лист - признаки брактеи, что указывает на возможную роль гена DET в эволюции соцветий бобовых. Изучены особенности фенотипического проявления мутации tendrilled acaciaA (tacA) в динамике онтогенеза. Описан характер взаимодействия гена ТАСA с другими генами, регулирующими развитие листа – AFILA, UNIFOLIATA, в том числе и на уровне экспрессии. Описано взаимодействие генов, регулирующих соцветие у гороха: FASCIATA (FAS, FA), DETERMINATE, LATE FLOWERING, SYMBIOTIC28 и NODULATION4. Построена обобщающая схема генетической регуляции активности апикальной меристемы у гороха посевного. В схеме отражены основные модусы регуляции: поддержание постоянного объема и недифференцированного состояния апикальной меристемы (гены FA, FAS, NOD4, SYM28, DET) и пролиферация (ген DEH). Впервые установлено, что некоторые мутации влияют на систему негативного контроля размеров апекса и участвуют в предотвращении флорального морфогенеза в терминальном положении пазушного соцветия. Выявлены новые мутантные аллели генов COCHLEATA и CRISPA, участвующих в регуляции развития прилистников и определении дорзовентральной симметрии листа. С применением молекулярных маркеров доказано, что мутант «Хлорофилл 4» гомозиготен по делеции, содержащей ген COCHLEATA. Завершена каталогизация мутантов гороха коллекции кафедры генетики МГУ, которые характеризуются нарушениями развития листа с изменениями на макро- и микроморфологическом уровнях (в том числе по структуре клеток эпидермиса). Описано разнообразие изучаемых признаков у различных промышленных сортов, линий, подвидов и видов гороха и получены приоритетные данные об особенностях строения листа в популяциях дикорастущего родственника гороха посевного - гороха красивого (Pisum formosum Alef.). Полученные данные указывают на перспективность вовлечения дикорастущего вида в селекцию этой ценной сельскохозяйственной культуры. 3. Генетический контроль систем устойчивости растений к стрессовым воздействиям. 3.1. Выявлена гомология ранее открытого гена ICE2 Arabidopsis thaliana. с геном ICE1, контролирующим адаптацию к холоду путем регуляции уровня экспрессии гена CBF3. Высокий уровень сходства выявлен в участках, кодирующих ДНК-связывающий домен bHLH. Первый экзон гена ICE2 является уникальным и содержит F-бокс, характерный для белков, вовлеченных в процессы убиквитинилирования. Этот домен показывает высокий уровень сходства с одним из F-бокс-содержащих генов из другой хромосомы арабидопсис, а также частичное сходство с ретротранспозонами других растений, что указывает на возможное происхождение гена ICE2 путем слияния паралога ICE1 с F-бокс-геном, опосредованное через перемещение мобильного генетического элемента. Изучение структурно-функциональных особенностей гена ICE2 показало, что ген содержит две функциональные единицы, экспрессия которых зависит от выбора промотора. Эти единицы определяют либо образование транскрипта, включающего 2 – 5 экзоны, либо синтез короткого транскрипта, содержащего 1-ый экзон. Полноразмерного транскрипта всего гена (1 – 5 экзоны) не выявлено. Полученные данные свидетельствуют в пользу независимого функционирования двух генов - гена, кодирующего домен с F-боксом и гена ICE2, который высокогомологичен ранее исследованному гену ICE1. 3.2. Проведен анализ стабильности наследования генной кассеты, содержащей ген Arabidopsis thaliana ICE2 под сильным промотором 35S, в половых и вегетативных поколениях трансгенных растений арабидопсис и культивируемых in vitro трансгенных линий табака. Показано, что длительное культивирование in vitro линий табака приводит к элиминации или существенным мутационным изменениям перенесенных в геном табака генных кассет и отсутствию экспрессии гена ICE2. В трансгенных растениях арабидопсис подтверждена стабильная передача генной кассеты в течение 5-ти половых поколений. В то же время, уровень транскрипции гена ICE2 в составе генной кассеты снижался в процессе половой репродукции. 3.3. Исследована функция гена ICE2 в адаптации растений к холодовому воздействию путем изучения экспрессии генов холодового ответа в растениях дикого типа и трансгенных растениях Т3 поколения, суперэкспрессирующих полноразмерную копию гена ICE2 и его делетированный вариант без 1-ого экзона. В трансгенной линии с полноразмерной копией гена ICE2 обнаружено усиление экспрессии гена CBF1, гена NCED3, контролирующего синтез абсцизовой кислоты (АБК) и генов RAB18, RD29А и RD29B – компонентов генной сети зависимой от АБК. Следовательно ген ICE2 контролирует ответ на холод, регулируя экспрессию как независимого от АБК CBF-регулона, так и зависимого от АБК ответа на холод. 3.4. Изучен ранее полученный в лаборатории мутант nfz24, обладающий перекрестной устойчивостью к окислительному стрессу, яркому свету и холоду. Выявлено влияние гена nfz24 на экспрессию генов АБК-зависимого ответа на холодовое воздействие: генов биосинтеза АБК – NCED3, а также на генов Rab18 и RD29A после гипотермического воздействия с использованием метода количественной ПЦР-РВ. Установлено, что гипотермическое воздействие (4°С в течение суток) на растения дикого типа приводит к активации транскрипции всех исследованных генов АБК-зависимого адаптивного ответа. Показано повышение уровня экспрессии гена NCED3 (в 140 раз), RD29A (в 180 раз) в растениях дикого типа, подвергнутых холодовому воздействию, по сравнению с растениями, постоянно растущими при оптимальной температуре 22-24°С. Уровень экспрессии гена Rab18 увеличивался только в 2 раза, тогда как в подвергнутых холодовому воздействию растениях мутанта изменений экспрессии этих 3-х генов не обнаруживалось. Полученные данные доказывают, что ген nfz24 участвует в контроле чувствительности к холоду путем активации синтеза АБК и генов АБК-зависимого ответа в растениях арабидопсис. 3.5. Проведен анализ внутривидовой изменчивости гена ICE2 в карельских расах арабидопсис, произрастающих на границе северного ареала обитания вида. Выявлен низкий уровень полиморфизма, свидетельствующий о действии на ген ICE2 стабилизирующего отбора и на его функциональную важность. Начаты исследования природного полиморфизма популяций арабидопсис по генам, контролирующим время зацветания и потребность к яровизации – признакам, играющим первостепенное значение в адаптации растений к разным климатическим условиям. Проведен анализ части кодирующей последовательности (1-ый экзон) и 1-ого интрона гена FRI, а также размера регуляторного 5′-района этого гена у природных рас популяций, растущих в разных климатических зонах. Установлено, что расы Ler, Dijon–M, Slavica, Eri–1, Pxd содержат протяженные делеции в регуляторной 5′-области гена FRI, что подтверждает ключевую роль гена FRI в адаптивной эволюции растений. Анализ гена FRI в 6-ти карельских популяциях показал наличие у них полноразмерной функционально активной регуляторной 5′-области. Выявлено ряд однонуклеотидных замен в интроне, а также замены в экзоне, которые либо не вызывали изменения аминокислотной последовательности, либо были связаны с синонимичными заменами аминокислот в белке. Таким образом, показано, что позднее цветение растений карельских популяций, растущих на северной границе ареала обитания вида, контролируется функционально активной доминантной аллелью гена FRI, задерживающей цветение. 3.6. Исследован полиморфизм генов анионной пероксидазы AtPrx53 и AtPrx54 в островных и континентальных северных популяциях арабидопсис. Подтверждено существование двух гаплогрупп гена AtPrx53, которые поддерживаются балансирующим отбором. Ген AtPrx54 показывает более высокий уровень изменчивости, в том числе вызванный перемещениями мобильных элементов. Показано существование горячей точки рекомбинации в гене AtPrx53 анионной пероксидазы арабидопсис. Причиной высокой частоты рекомбинаций является генная конверсия с использованием в качестве матрицы материнской аллели. Выдвинута гипотеза об участии генной конверсии в поддержании в популяции адаптивно значимых аллелей, определяющих вклад стабилизирующего отбора в эволюцию геномов растений.