ИСТИНА

Проект посвящен исследованию филогении, эволюции и морфологии двух больших родственных групп ракообразных Thecostraca и Tantulocarida. Тантулокариды – мельчайшие паразитические ракообразные со сложным жизненным циклом, включающим половую и партеногенетическую фазы, свободно плавающих личинок и паразитические стадии. Тантулокариды паразитируют на различных бентосных ракообразных: Tanaidacea, Copepoda, Ostracoda, Cumacea и Amphipoda. Сложный жизненный цикл, микроскопические размеры и обитание в мейофауне делали до настоящего времени невозможным полноценное исследование этой группы. Кроме того, морфология тантулокарид сильно изменена паразитическим образом жизни и трудно выделить признаки, пригодные для анализа их родственных связей с другими Crustacea. До наших исследований отсутствовали данные по сиквенсам ДНК этих ракообразных. В ходе выполнения проекта будут проведены масштабные исследования различных генетических маркеров: ядерных (18S, 28S ) и митохондриальных (16S, CO1 ), а также некоторых белок кодирующих генов. Будет исследована наружная морфология и анатомия личинок Thecostraca и всех стадий Tantulocarida для поиска возможных синапоморфий. Кроме того, будет выявлен комплекс морфологических адаптаций к паразитизму у Tantulocarida и Thecostraca, большинство таксонов которых паразитические. Нами будет описан ряд новых таксонов Tantulocarida, Ascothoracida и Facetotecta. Также будет проведен анализ филогении внутри самих тантулокарид и предложена принципиально новая система

За время реализации проекта (2015-2017 гг) нами получен целый ряд интересных новых результатов по ракообразным классов Tantulocarida и Thecostraca, свидетельствующих о выполнении нами поставленных целей и задач. Полученные нами результаты можно сгруппировать в два кластера: I) молекулярно-генетические данные, необходимые для достоверной реконструкции филогенетических отношений между Tantulocarida и основными подклассами класса Thecostraca (Ascothoracida, Facetotecta, Cirripedia) и II) морфолого-анатомические данные, призванные подкрепить наши филогенетические построения, необходимые для реконструкции эволюционных процессов внутри исследуемых групп и построения естественной систематики и систематики этих ракообразных. Сбор и обработка материала, в основном осуществлялась нами на базе Беломорской биологической станции МГУ, а также на Биологическом факультете МГУ. Дополнительный материал по Ascothoracida и Facetotecta был собран нами на Тайване в ходе выполнения совместных проектов (см. далее). Кроме того, в 2016 г. одному из представителей нашего коллектива (Петруниной А.С.) неожиданно выпал уникальный шанс поучаствовать в Немецко-Российском глубоководном рейсе (So250) на немецком судне «Sonne», который проходил с августа по октябрь 2016 г. в Тихом океане в районе Курило-Камчатского желоба (KURAMBIO II). Воспользовавшись этим шансом, был собран уникальный материал по глубоководным Tantulocarida и Thecostraca (Ascothoracida). Дело в том, что ракообразные класса Tantulocarida имеют, в основном, глубоководное распространение. Большинство видов описано с глубин более 1000 метров. Собрать такой материал самостоятельно просто невозможно, это осуществимо только в ходе специализированных глубоководных экспедиций. Известно, что на больших глубинах тантулокариды распространены практически повсеместно (Атлантический, Тихий, Индийский океаны), однако предыдущие находки ограничивались абиссальными глубинами до 5000 метров. В ходе экпедиции KURAMBIO II нам удалось собрать уникальный материал по данной группе ракообразных с ультраабиссальных глубин, что впервые подтверждает их распространение в хадальной зоне Мирового океана. В ходе разбора проб на борту Зонне, тантулокариды (паразитические стадии жизненного цикла) были обнаружены в пробах на всех исследованных глубинах: от 5500 м до 9300 м. В ультраабиссальной зоне Мирового океана (глубже 5000 м) тантулокариды отмечены впервые. Что касается хозяев, то из всего спектра в Курило-Камчатском желобе были представлены только Harpacticoida (предварительно, 9 родов из нескольких семейств) и один вид равноногих раков (Isopoda: Macrostyllidae). I) Исследование молекулярной филогении таксонов Thecostraca и Tantulocarida. 1. Построение филогении Thecostraca и Tantulocarida — это одна из основных целей нашего проекта. Известно, что класс Tantulocarida и класс Thecostraca являются близкородственными (Boxshall 1991; Huys et al. 1993; Martin, Davis 2001). Морфологически это подтверждается схожим тагмозисом личиночных стадий, а также расположением гонопоров самца и самки. Однако, степень этого родства до сих пор достоверно не определена. Нами уже была осуществлена попытка выяснения реально положения Tantulocarida на древе всех ракообразных по молекулярным данным (Petrunina et al., 2014). Однако, для построения филогении был использован только один ген 18S. Полученный нами результат — сестринское положение тантулокарид по отношению к усоногим ракообразным, не очень отчетливо поддерживается морфологически. В частности, в качестве синапоморфии нового таксона Tantulocarida + Cirripedia можно назвать только наличие головных цементных желез и способ прикрепления организмов к субстрату при помощи клейкого вещества- цемента. Кроме того, включение тантулокарид внутрь класса текострак ставит вопрос о монофилии последнего, которая до последнего времени считалась неоспоримой, так как была установлена на основании морфологических и молекулярных признаков. Таким образом, для разрешения сложившейся ситуации, необходимо провести молекулярный анализ с большим числом генетических маркеров. Необходимо отметить, что из имеющегося арсенала генов для реконструкции филогении таксонов высокого ранга подходят только консервативные последовательности, такие как например, гены 18S, 28S, а также белок-кодирующие гены. Общепринятая на данный момент филогения ракообразных, и членистоногих в целом, как раз построена в основном, на базе анализа белок кодирующих последовательностей (Regier et al., 2010). Было принято решение использовать данный подход и для реконструкции филогении Thecostraca + Tantulocarida. Мы выбрали четыре белок кодирующие последовательности, кодирующие белки альфа адаптин, фактор сплайсинга, АТФ синтаза и клатрин (a-adaptin, splising factor, Atp synthase, Clathrin), которые были успешно получены для многих групп ракообразных из работы Ригера. Однако, для нашей задачи недостаточно получить сиквенсы данных генов только для тантулокарид. Необходимо было получить эти последовательности еще и для Facetotecta и Ascothoracida, для которых данные по этим генам отсутствуют. Включение представителей всех трех подклассов текострак в наш анализ необходимо для установления реального положения Tantulocarida на древе Crustacea. Проблема заключается в том, что для получения сиквенсов этих генов необходимо выделение РНК, что в свою очередь требует использование свежего материала или существенного количества тканей, зафиксированных RNALater. Самым проблематичным в этом отношении таксоном является Facetotecta, так как их планктонные личинки встречаются редко и имеют микроскопические размеры. Сбор и фиксация живого материла для молекулярного анализа осуществлялись нами в разных точках мирового океана. Так, фасетотекты и некоторые аскоторациды были собраны на Тайване, отдельные представители аскоторацид были получены живыми в ходе глубоководных тралений, тантулокариды были получены на ББС МГУ. В результате нам удалось получить последовательности трех белок кодирующих генов для Tantulocarida, двух для Ascothoracida, и только одного гена (Spl) для Facetotecta. Нам не удалось получить полный набор выбранных генов, что во многом связано со сложностями в сиквенировании белок кодирующих последовательностей как самих Tantuloсarida, так и Ascothoracida и Facetotecta. Как известно, паразитические таксоны демонстрируют высокую скорость эволюции, что могло проявиться и на выбранных нами последовательностях. В результате, праймеры, подходящие для всех остальных свободноживущих ракообразных, могут быть неприменимы в нашем случае. Для построения филогенетических деревьев были также использованы сиквенсы 18S и 28S (получены нами впервые) тантулокарид, а также последовательности этих генов различных Ascothoracida и одного вида Facetotecta, взятые нами из генбанка. В первую очередь, дерево, построенное нами по генам 18S+28S, подтверждает выдвинутую ранее гипотезу о близком родстве Tantulocarida и Cirripedia. (см. файл с презентацией, Рис. 1). Однако, дерево, включающее один из белок кодирующих генов (Splicing factor), полученный нами для всех выбранных таксонов, опровергает это утверждение (см. файл с презентацией, Рис. 2). На данном дереве Tantulocarida оказываются сетринским таксоном ко всем Thecostraca, как и предполагалось до наших исследований (Martin, Davis 2001). Помимо морфологических оснований для сестринского родства Tantulocarida и Thecostraca, существуют еще и молекулярно-филогенетические исследования, которые также подтверждают данную гипотезу. В недавней работе, где приводится дерево всех ракообразных, построенное по 18S, 28S, H3 и CO1, Tantulocarida располагаются также в качестве сестринского таксона всем Thecostraca (Khodami et al., 2017). Cтоит обратить внимание, однако, что авторы не включили в анализ такой важный таксон, как Facetotecta. Именно отсутствие в этой работе сиквенсов фасетотект не позволяет сделать окончательный вывод о филогенетическом положении Tantulocarida. Анализируя полученное нами дерево, отдельно следует обсудить возможное внутреннее расположение Facetotecta среди остальных Ascothoracida, что на первый взгляд является спорным результатом. Однако, фасетотекты — это малоизученная группа загадочных морских ракообразных. Помимо планктонных ларвальных стадий, никакие другие этапы развития фасетотект до сих пор не описаны. Предполагается, что на взрослой стадии, они являются эндопаразитами каких-то беспозвоночных. Такой образ жизни демонстрируют и многие аскоторациды. Таким образом, несмотря на явные отличия в строении циприсовидной личинки (Høeg, Kolbasov, 2002; Kolbasov et al., 2008), фасетотекты и аскоторациды, имеющие при этом внешне сходные науплиальные стадии, могут на самом деле демонстрировать более близкое родство, чем считалось ранее. Проанализировав наши собственные и литературные данные, мы можем сделать вывод о более вероятном сестринском положении Tantulocarida по отношению к Thecostraca, что подтверждается также рядом синапоморфий текострак, которые отсутствуют у тантулокарид. Главный морфологический критерий здесь — это наличие у Ascothoracida, Facetotecta и Cirripedia, т.е. у всех Thecostraca, так называемых решётчатых органов, которые отсутствуют у Tantulocarida. Молекулярно-генетические исследования, нацеленные на реконструкцию высокоранговой филогении всех Crustacea, будут нами продолжены в продолжающихся проектах РФФИ (17-54-52006 МНТ_а, «Мешкогрудые ракообразные (Ascothoracida, Thecostraca) - паразиты книдарий и иглокожих. Реконструкция филогении с использованием морфологических и молекулярных методов и эволюция паразитизма внутри группы» и 18-04-00624 А «Сто лет без побед или Y-личинки Facetotecta - старейшая загадка морской биологии»). Тем более, что такое перспективное направление, как полногеномное секвенирование, становится все более и более доступным даже для таких сугубо фундаментальных задач. Этот подход в будущем позволит нам получить более полный набор белок кодирующих генов, а также некоторые другие консервативные последовательности для Ascothoracida, Facetotecta и Tantulocarida, и, следовательно, получить более достоверные данные по их филогении. 2. В рамках исследования молекулярной филогении крупных таксонов Thecostraca нами (Lin et al., 2016) впервые проведён молекулярно-генетический анализ усоногих ракообразных надотряда Acrothoracica (Cirripedia, Thecostraca), представленных небольшими, сверлящими, раздельнополыми эпибионтами (большая самка с карликовыми самцами), обитающими в известковых осадках и скелетах морских беспозвоночных. Акроторацики представляют наиболее примитивных Cirripedia и имеют большое значение филогенетических реконструкциях этих ракообразных и Thecostraca в целом. Колбасов (Kolbasov 2009) провёл ревизию надотряда Acrothoracica, основанную на морфологии самок, карликовых самцов и циприсовидных личинок, и выделил два новых отряда акроторацик Lithoglyptida и Cryptophialida. Была впервые осуществлена реконструкция молекулярной филогении усоногих надотряда Acrothoracica, основанная на молекулярном анализе двух митохондриальных (COI и 16S) и двух ядерных (18S и Histone H3) маркёров. Исследованы 8 из 11 известных родов акроторацик, включающие 23 вида. Монофилия всех 8 родов акроторацик, исследованных нами, находит сильную поддержку. Родственные связи между семействами согласуются с морфологической реконструкцией филогении, предложенной Kolbasov, Newman, Høeg. Реконструирована эволюция основных морфологических признаков и определены их плезиоморфные и апоморфные состояния. Установлено, что редукция числа терминальных усоножек самок происходила независимо несколько раз в ходе эволюции Acrothoracica. Также показано, что редукция ротовых придатков самок происходила дважды в ходе эволюции надотряда. Апоморфными стояниями самок являются: редуцированные ротовые конечности и уменьшение числа терминальных усоножек, которые могут становиться одноветвистыми. Для карликовых самцов исходным состоянием являются самцы с грушевидной формой тела, лишённые боковых выростов, и с прикрепительными антеннулами, лишёнными длинного стебелька. У эволюционно продвинутых форм карликовые самцы обладают длинным стебельком прикрепительных антеннул и боковыми выростами тела, являющимися дополнительными ёмкостями для удлинённого пениса. Причём образование этих выростов произошло независимо в семействах Trypetesidae и Lithoglyptidae. Дополнительно был описан новый глубоководный вид акроторацик Weltneria acanthostoma, обнаруженный в районе подводного хребта Blue Ridge Seamount, Южно-Китайское море, на глубине 534 м (Kolbasov et al. 2017). Одна самка была найдена в норе в склерактинии Madrepora oculata. Этот экземпляр относится к роду Weltneria из-за наличия 6 пар усоножек и двусоставных каудальных придатков. Wantneria acanthostoma отличается от других видов рода морфологией слегка синусоидных оперкулярных утолщений и отсутствием известкового образования в области прикрепительного диска. Нами показано, что род Weltneria демонстрирует реликтовое Тетисное распределение. Было установлено, что диагноз Weltneria основан на симплеоморфиях и род может быть немонофилетическим таксоном. II) Изучение жизненных циклов, систематики, морфологии и анатомии, описание новых таксонов Thecostraca и Tantulocarida. 3. Описание новой стадии жизненного цикла Tantulocarida — науплиуса (см. файл с презентацией, Рис. 6). В ходе сотрудничества с немецким коллегой (проф. П. Мартинес Арбизу), нами осуществляется изучение и описание новой стадии жизненного цикла Tantulocarida. Около 15 лет назад в глубоководных пробах мейобентоса стали находить микроскопических личинок очень странной морфологии. Небольшое (от 25 до 70мкм) овальное или вытянутое тело этих существ несёт только одну пару конечностей . Автором находки — Педро Мартинесом Арбизу был сделан вывод о том, что это науплиусы каких-то ракообразных. Только накопив обширный материал по этим личинкам, он смог выделить несколько стадий развития и определить таксономическое положение загадочных личинок. Оказалось, что это науплиусы Tantulocarida. Дело в том, что на более поздних стадиях развития внутри науплиуса удается разглядеть развивающегося тантулюса. По-видимому, науплиусы растут без линьки, и внутри них постепенно созревает следующая стадия — тантулюс, которую легко определить морфологически по наличию шести пар конечностей с характерными вилочкообразными эндоподитами. Эта уникальная находка, однако, не была оформлена в виде публикации, также до сих пор нет описания этой стадии жизненного цикла тантулокарид. В рамках научной стажировки в Немецком центре по изучению биоразнообразия нам удалось изучить строение науплиусов Tantulocarida при помощи конфокальной и сканирующей электронной микроскопии. Науплиусы представляют собой яйцевидное тело с одной парой сегментированных конечностей (скорее всего антеннулы), каждый сегмент которых характеризуется дополнительными складками. Внутри этих конечностей-выростов проходят три мышечных тяжа, которые, однако, скорее всего резорбируются по ходу развития внутри науплиуса личинки следующей стадии — тантулюса. По-видимому, науплиусы не способны к активному плаванию и даже вообще не способны к активному перемещению. Подвижные конечности используются ими только для разрыва яйцевых оболочек. Особый характер распределения личинок на морском дне, свидетельствует в пользу того, что они не способны к распространению: обычно в пробе собранной с площади 10 см2 их находят группами по 15-30 особей. Проследить развитие личинок одного вида, не представляется возможным, однако в ходе изучения всех найденных экземпляров, было выделено как минимум два морфотипа. К первому типу относятся науплиусы с относительно короткими заостренными антеннами, у второго типа конечности очень длинные (приблизительно равны длине тела) и закругленные на конце. У науплиусов, собранных в районе Курило-Камчатского желоба, на вентральной стороне тела были обнаружены парные кутикулярные выросты. Возможно, это структуры, которые можно гомологизировать с фронто-латеральными рожками усоногих. По-видимому, науплиусы, а не тантулюсы, как считалось ранее (Huys et al., 1993), являются результатом полового размножения у тантулокарид. Оплодотворение происходит в результате копуляции самца и самки, после чего самка, скорее всего, зарывается в грунт и погибает. Науплиусы покидают цефалоторакс самки через разрыв кутикулы. Важно отметить, что науплиальные стадии тантулокарид были обнаружены нами и на Белом море, что свидетельствует в пользу наличия половой фазы жизненного цикла у беломорских видов. Нами готовится публикация с описанием жизненного цикла ракообразных Tantulocarida. 4. Изучение анатомии Tantulocarida. Строение личинки тантулюса. Нами сдана в печать статья с описанием внутреннего строения личиночной стадии Tantulocarida – тантулюса (Petrunina et al., inpress). Коллектив соавторов очень долго вынашивал эту публикацию, что связано с продолжающимися исследованиями материала и попыткой осмыслить реальную организацию систем органов этой инвазивной стадии, многие из которых являются уникальными среди ракообразных. Основной проблемой для реконструкции внутреннего строения тантулюса являются его микроскопические размеры, а также факт быстрой деградации многих структур после оседания на хозяине. Дело в том, что личинка тантулюс после прикрепления к хозяину переходит к паразитированию, и вскоре претерпевает метаморфоз. На изученных с помощью ТЭМ беломорских видах Acrticotantulus pertzovi и Microdajus tchesunovi, нами было показано, что даже у недавно осевших личинок многие структуры успевают деградировать. Например, быстрой резорбции подвергаются мышцы ретракторы и протракторы стилета, а также ретракторы хоботка. Кроме того, цементные железы также подвергаются деструкции, так как выделение самого цемента происходит только один раз в жизни личинки. В дополнение к публикуемым данным, нами был получен уникальный материал — свободные личинки тантулюсы из мейобентосных проб. Полученные при помощи мультикорера мейобентосные пробы прямо на борту НИС Зонне были зафиксированы формалином. Уже в лаборатории Педро Мартинеса Арбизу грунт был центрифугирован с левазилом и каолином, что позволяет разделить фракции на органическую и неорганическую. Органическая фракция (животные и детрит) была окрашена бенгальской розой, в результате чего мейобентосные животные становятся лучше видны, так как окрашиваются в розовый цвет. Разбор проб осуществлялся техническим персоналом лаборатории изучения биоразнообразия (Зенкенберг). Отобранные животные были зафиксированы 96% спиртом. Очевидно, что такой материал не подходит для исследований с применением трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Однако, оказалось, что внутренние структуры даже таких микроскопических существ можно выявить при помощи конфокального микроскопа. Особи были окрашены смесью красителей Конго красный, кислый фуксин и красителя Шила. Важно отметить, что полученные данные существенно дополняют наши знания о внутренней анатомии тантулокарид. Таким образом, полноценная реконструкция всех систем органов личинки тантулюса возможна только в результате дополнительного изучения свободных, еще не осевших тантулюсов. Нами были исследованы два экземпляра разных видов. Получены максимальные проекции, а также серии фотографии фронтального и латерального ракурса (см. файл с презентацией, Рис. 3, 4). Полученные данные позволяют впервые достоверно показать наличие и расположение таких структур цефалона личинки, как мышцы протракторы и ретракторы стилета, ретракторы хоботка. Ретракторы стилета - парные пучки мышц, которые своей задней частью крепятся к задней стенке головы личинки, а передней - непосредственно к стилету. Мышцы протракторы, обнаруженные нами впервые, представляют собой четыре отдельных пучка, соединяющих дорсальную стенку головы тантулюса с расширенным основанием стилета. Место прикрепления мышц к кутикуле цефалона располагается значительно ближе к переднему краю головы, чем задний край стилета. Таким образом, сокращение именно этих мышечных пучков приводит к выдвижению стилета через ротовое отверстие. Впервые доказано, что хоботок тантулюса способен вворачиваться обратно в цефалон за счет парных пучков мышц. Эти чрезвычайно тонкие пучки идут параллельно, и лишь в задней части расходятся, прикрепляясь к кутикуле задней стенки головы, ближе к верхней ее части. Впервые достоверно показана локализация и строение парных цементных желез, состоящих из шести клеток с крупными ядрами и многочисленными везикулами с клеящим цементом. На полученных фотографиях отлично визуализируется компактный мозг личинки, состоящий из плотно упакованных мелких нейритов и достаточно объемного нейропиля. Впервые достоверно показано устройство мускулатуры сегментов тела тантлуюса, а также наличие объемной брюшной нервной цепочки, с центральным нейропилем. Внутреннее строение самца Жизненный цикл тантулокарид включает как паразитические, так и свободно живущие стадии (половая самка и самец). Свободно плавающие, не питающиеся самцы тантулокарид иногда встречаются в меойбентосных пробах. Однако, эта стадия крайне мало изучена. Нами впервые были подробно изучены дефинитивные самцы двух беломорских видов Tantulocarida, выведенные нами в культуре, с точки зрения их наружной морфологии (Petrunina, Kolbasov, 2012). Также, нами впервые получены данные об их анатомии (см. файл презентации, Рис. 5). Покровы самца представлены кутикулой со слоистой структурой, однако без разделения на экзо- и эндокутикулу, толщина которой составляет 0,6 мкм. Показано, что элементы орнаментации цефалоторакса — гребни и ламеллы — формируются только самым верхним слоем эпикутикулы. Под кутикулой располагается слой гиподермы, состоящий из клеток с уплощенными ядрами и однородной цитоплазмой, имеющей включения в виде гранул с однородным содержимым. У самцов обоих видов обнаружены так называемые вентро-латеральные полости цефалоторакса — парные области, отграниченные от центральной части кутикулярным слоем. Назначение этих полостей до конца не ясно, но мы предполагаем, что они используются как хранилище запасных веществ. Именно в передней части вентро-латеральных полостей берут начало эстетаски. Центральная нервная система самцов тантулокрарид состоит из головного мозга и брюшного нервного ствола, идущего от мозга вплоть до первого абдоминального сегмента. Мозг смещён во вторую треть цефалоторакса сотовидной структурой. Его передняя часть двулопастная, а максимальный диаметр около 27 мкм. В центральной части головной мозг несёт обширный нейропиль, окаймлённый телами нейронов. Сенсорный аппарат самцов тантулокарид представлен двумя группами эстетасков, отходящих от передней части цефалоторакса и семью парами чувствительных пор с сенсиллами, которые располагаются на поверхности головного щита. Тонкая кутикула каждого эстетаска окружает пучок из нескольких дендритов. Нами описаны два типа сенсорных пор самца, а также показано, что пучки сенсилл, выходящие из некоторых пор, имеют общее основание, и представляют собой одну сильно разветвленную щетинку. В передней части цефалоторакса, непосредственно перед мозгом нами была обнаружена уникальная по своему строению так называемая «сотовидная структура». Сотовидная структура — это группа плотно упакованных клеток, размер которых не превышает 1 мкм. Сама сотовидная структура не имеет собственной оболочки, её клетки непосредственно контактируют с гиподермальными или нервными. Внутренний состав клеток вызвал у нас большое удивление. Дело в том, что центральная вакуоль, имеющаяся в каждой клетке и занимающая основной её объём, не похожа на типичное ядро. В тоже время, в клетке имеется некое электронно-плотное образование, окружающее центральную вакуоль как будто колпаком. Возможно, именно это и есть ядра с крайне сильно конденсированным хроматином, что характерно для спермиев различных животных. Отчасти, это подтверждается нашими конфокальными фотографиями, на которых при помощи красителя Dapi в передней части головы выявляются обособленные структуры с хроматином. На фотографиях, полученных при помощи ТЭМ, мы не смогли обнаружить ни митохондрии, ни микротрубочки, более того, свободная цитоплазма в клетках сотовидной структуры почти отсутствует. Несмотря на некоторые сомнения, мы считаем, что сотовидная структура — это гонада самца, ведь в других частях тела взрослого самца, половая железа обнаружена не была. Однако, несколько фактов противоречат нашему предположению. Во-первых, сама локализация сотовидной структуры в передней части цефалоторакса, непосредственно перед мозгом и отсутствие, связанных с ней протоков, ведущих к пенису, ставит под сомнение возможности функционирования такой гонады. Во-вторых, клетки структуры не имеют митохондрий, а также микротрубочек, входящих в состав хотя бы рудиментарного жгутика. Известно, что у многих ракообразных жгутик сперматозоидов не развит. Однако, представители близкородственного таксона Thecostraca, в основном имеют спермии со жгутиком. По нашему мнению, сперматозоиды тантулокарид тоже должны иметь хотя бы рудиментарный жгутик. В тоже время, известно, что гонады Ascothoracida, в том числе семенники образуют дивертикулы в карапаксе, являющимся выростом головного сегмента (максиллярного). Поэтому нельзя полностью отрицать гомологию этой структуры с мужской гонадой. Мускулатура сегментов и торакоподов самцов тантулокарид изучена с помощью конфокальной и трансмиссионной электронной микроскопии. Два мощных продольных тяжа идут через все торакальные сегменты из цефалоторакса, где они крепятся к дорсальной (разгибатели) и вентральной (сгибатели) стенке. Также, наблюдаются дорсо-вентральные тяжи и пучки идущие в торакоподы. В свободных торакальных сегментах мускулатура занимает весь объем, за исключением вентральной нервной цепочки и тонкого слоя эпидермиса. Получены данные о наличии мускулатуры пениса — это парные мускулы - разгибатели, которые крепятся к дорсальной стенке первого абдоминального сегмента и к вентральной стороне самого пениса. Параллельно одним из наших исполнителей (Н.Ю. Неретин) была исследована анатомия амфиподных желёз, выделяющих специальный «амфиподный шёлк», служащий для прикрепления к субстрату и строительства особых «мачт», на которых обитают семьи амфипод-корофиид. Прикрепительные цементные железы обнаружены нами у тантулокарид, их анатомия детально изучена. Кроме того цементные железы характерны для родственных Cirripedia. Изучение аналогичных желез у других Crustacea даёт нам необходимый материал для сравнения структур желёз, выявления гомологий и их эволюции в этом крупнейшем таксоне. Были изучены различные аспекты биологии амфиподы Dyopedos bispinis, строящей "мачты" и распространённой в Белом море. Чтобы изучить особенности мачтового строения у Dyopedos bispinis исследовалась социальная структура семей, обитающих на мачтах, определялись предпочтительные субстраты посредством подводной фотографии и прямых наблюдений, охарактеризовались внутренние и внешние структуры мачт и изучалась ультраструктура переоподного шёлка с использованием сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (SEM и TEM, соответственно). Наиболее частыми субстратами для строительства мачты являются другие организмы-обрастатели, включая гидроидов, мшанок, асцидий и губок. Как и у других корофиид, каждая мачта Dyopedos bispinis представляет собой территорию одной самки, а иногда и одного самца, но также наблюдаются уникальные коллективные мачты, занятые тремя или более (до 23) взрослыми. Мачты включают один или 2-4 центральных цилиндра и ламинированную кору, содержащую слои детрита и амфиподного шёлка. Переоподный железистый комплекс Dyopedos bispinis состоит из двух отдельных групп желёз, проксимальных и дистальных, в каждом переоподе 3-4, а протоки в железистом комплексе приводят в общую камеру в дактилюсе. Проксимальные железы многоклеточные; их секреторные клетки являются одноядерными, в отличие от некоторых других амфипод. Инвагинации заполнены расширениями цитоплазмы клеток подкладки, но происхождение подкладки неясно. Рядом с секреторными клетками наблюдались контакты аксонов, и предполагается, что эти аксоны регулируют амфиподные шёлковые железы. Проксимальные шёлковые железы Dyopedos bispinis имеют сходство с лопастными и розеточными железами изопод, но характеризуются сильно вытянутыми формами. Они представляют так называемые псевдотубулярные железы. Такие железы редко наблюдаются у ракообразных и описаны только в шёлкообразующих передопальных системах морских перкарид и в антеннах наземных малакострак. По полученным данным опубликована статья (Neretin et al., 2017). 5. Описание новых таксонов Tantulocarida и Thecostraca. В ходе выполнения проекта были описаны 2 новых вида тантулокарид, найденных глубоководной экспедицией ANTARKTIS XIII / 5 RV Polarstern в 1996 году (Martinez Arbizu, Petrunina 2017). Это Tantulacus coroniporus sp.nov. и Polynyapodella thieli sp.nov. Род Tantulacus характеризуется выраженным шипом на эндоподитах торакоподов 2-5 личинки tantulus. Новый вид помещен в этот род, т.к. обладает этим признаком и является первым глубоководным видом этого рода. Таким образом, в настоящее время род состоит из пяти видов, которые широко распространены в Мировом океане. Известно, что вид Polynyapodella ambrosei Huys, Møbjerg, Kristensen, 1997, также представлявший монотипический род, имеет только одну щетинку на экзоподите торакоподов 1-5, что является уникальным среди танулокарид, за исключением монофилетического семейства Microdajidae, имеющего уменьшенные ветви на грудных конечностях. Второй новый вид, описываемый в публикации, относится к роду Polynyapodella на основании этого признака; однако его можно отличить от P. ambrosei по формуле головных пор и морфологии фуральных щетинок. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) была впервые использована для изучения внешней морфологии личинки tantulus (см. файл с презентацией, Рис.7). Благодаря её использованию был обнаружен целый ряд мелких элементов орнаментации кутикулы и придатков. Кроме того, были исследованы некоторые детали анатомии танулокарид. Нами были полностью разобраны пробы глубоководного планктона из района Курило-Камчатского желоба, полученные в ходе экспедиции KURAMBIO II. Было отобрано более 40 экземпляров планктонных гарпактицид сем. Aegisthidae (род Pontostratiotes), зараженных тантулокаридами. Подсчитано, что средняя зараженность составила около 10 %. Паразиты были представлены различными стадиями: личинки-тантулюсы, развивающиеся самцы, развивающиеся партеногенетические самки. Кроме того в этом материале нами была обнаружена развивающая половая самка тантулокарид. Это уникальная находка, так как самки тантулокарид были найдены всего дважды за всю историю изучения этого таксона. Помимо экземпляров паразитов, прикрепленных к хозяевам, был обнаружен один экземпляр свободной личинки — тантулюса. Это позволит подготовить полноценное описание нового вида, с применением конфокальной, световой, а также сканирующей электронной микроскопии. Полученные экземпляры были определены , как принадлежащие к новому роду и новому виду семейства Basipodellidae. Одним из важных определительных признаков для этого семейства, является способ формирования кутикулярного мешка в ходе метаморфоза личинки в самца. Для базиподеллид характерно наличие дополнительного вздутия между первым сегментом торакса и головой, причем, как с дорсальной так и с вентральной стороны. Однако, наши экземпляры демонстрируют немного отличный способ закладки мешка. Подобное кутикулярное вздутие образуется у нового вида исключительно под цефалоном. Кроме того, новый вид отличается от всех ранее описанных тантулокарид наличием очень характерных двух пар закругленных выростов головного щита, располагающихся на его заднем крае с боков (см. файл с презентацией, Рис.8). Помимо, таких очевидных отличий имеется еще целый ряд особенностей строения конечностей, а также особое распределние и количество головных пор, которое описывается по формуле AI, AIV, DI-III, где поры AI и DI несут по одной щетинке. Отдельно стоит отметить, что описываемый нами новый вид - это первый случай заражения тантулокаридами планктонных ракообразных. Хозяева были собранны при помощи мультинета с глубин 5900-3000м. Хотя существуют бенто-пелагические гарпактициды, которые могут всплывать над поверхностью грунта, хозяева тантулокарид в данном случае являются типично планктонными существами. Дело в том, что максимальная глубина, с которой брали планктон, составляла 5900 м, в то время как общая глубина в точках сбора составляла более 8000м. Таким образом, планктон, собранный в двух километрах над поверхностью дна, не может включать бентопелагические виды. Одной из интересных находок, сделанных в ходе экспедиции KURAMBIO II, было обнаружение изоподы Macrostyllus sp. (сем. Macrostyllidae), зараженного тантулокаридой. У нас имеется всего один экземпляр, однако, это все равно позволяет нам сделать полноценное описание вида, так как это паразит на стадии развивающегося самца и можно исследовать и описать строение личиночной стадии (тантулюса) данного вида, внутри которой развивается самец, а также изучить морфологию самца. Изоподы уже были зарегистрированы в качестве хозяев тантлоукарид семейства Doryphallophoridae. Однако, это всего лишь пятая находка подобной пары паразит-хозяин. Кроме того, новый вид представляет собой самую глубоководную дорифаллофориду. Полученный экземпляр был изучен нами при помощи конфокальной микроскопии (см. файл с презентацией, Рис. 10). После зарисовки основных признаков на световом микроскопе, мы сможем с большей детальностью исследовать образец при помощи сканирующего электронного микроскопа и подготовить рукопись статьи с его описанием. В ходе разбора мейобентосных проб из экспедиции INDEX 2011 (INDian Ocean EXploration), был обнаружен единственный экземпляр клешненосного ослика (Tanaidacea gen sp.), зараженного тантулокаридами рода Microdajus. Всего на хозяине было прикреплено четыре особи паразита, находящихся на разных стадиях развития: тантулюс, не приступивший к метаморфозу, два развивающихся самца и партеногенетическая стадия, представленная опустошенным кутикулярным мешком (см. файл с презентацией, Рис. 9). Данный материал позволяет достаточно подробно изучить морфологию личиночных и взрослых стадий с применением световой, конфокальной и сканирующей электронной микроскопии. Уникальный набор структурных признаков личинки-тантулюса и самца позволяют отнести данных паразитов к новому виду рода Microdajus (сем. Microdajidae), представители которого паразитируют исключительно на танаидах. Новый вид Microdajus indioceani sp. nov. имеет, в частности, минимальный набор головных пор (две пары), характерный еще только для одного вида M. aporosus Grygier et Sieg 1988. Кроме того, для нового вида характерно наличие как апоморфных , так и плезиоморфных морфологических признаков: в отличие от M. langi, M. gaelicus и M. pectinatus, у тантулюса имеется две (а не одна) щетинки на шестом торакоподе, а также модифицированная (укороченная и утолщенная) фуркальная щетинка. В тоже время самцы нового вида имеют одну характерную щётковидную щетинку на медиальном эндите шестого торакопода, которая у видов M. langi, M. aporosus и M. tchesunovi, по—видимому, подверглась редукции. Пробы были получены из зоны гидротермальных источников. Таким образом, это вторая находка тантулокарид, ассоциированных с фауной гидротерм. В настоящее время заканчивается приготовление рукописи с описанием этого вида. Нами проведены масштабные исследования морфологии и молекулярной генетики ракообразных подкласса Ascothoracida. Ракообразные подкласса Ascothoracida, паразитирующие на книдариях и иглокожих, являются наиболее примитивными представителями Thecostraca (Kolbasov et al., 2008; Høeg et al., 2009). Для этой группы имеются крайне малочисленные молекулярно-генетические данные по ограниченному набору маркёров (в основном 18S и 28S) для единичных видов (в основном род Dendrogaster). Сама систематика подкласса основана на использовании ряда плезиоморфных признаков (Grygier, 1985, 1987) и носит искусственный характер. Молекулярно-генетических данных до наших исследований было недостаточно для разрешения филогенетической трихотомии между Ascothoracida, Facetotecta и Cirripedia. Привлечение данных (молекулярных и морфологических) очень приветствовалось для реконструкции взаимоотношений между Tantulocarida и основными группами Thecostraca, а, следовательно, представлялось одним из важных исследований проекта. В ходе выполнения работ по Российско-Тайваньским грантам РФФИ (17-54-52006 МНТ_а, «Мешкогрудые ракообразные (Ascothoracida, Thecostraca) - паразиты книдарий и иглокожих. Реконструкция филогении с использованием морфологических и молекулярных методов и эволюция паразитизма внутри группы». 14-04-92002 ННС_а, «Усоногие ракообразные (Cirripedia, Balanidae, Acastinae) - симбионты губок и книдарий. Систематика, молекулярная филогения и эволюция симбиотических отношений»), в окрестностях о. Лю Дао (2015-2017 гг) нами в ходе водолазных погружений был собран обширный материал по шести родам мешкогрудых ракообразных (Ascothoracida). Взрослые особи родов Baccalaureus (4 вида), Zibrowia (1 вид) и Petrarca (4 вида) были обнаружены в ходе препарирования мягких кораллов Zoanthidae и склерактиниевых кораллов родов Tubastrea и Turbinaria соответственно. На колонии альционарии (горгонарии) обнаружен новый вид рода Gorgonolaureus. Самой интригующей находкой стало обнаружение в 2017 г. (впервые для науки) живых особей родов Synagoga (1 новый вид) и Sessilogoga (1 новый вид) являющихся наиболее примитивными таксонами аскоторацид, паразитирующими на антипатариях. Несколько экземпляров каждого рода были зафиксированы RNAlater для последующего выделения РНК. Нами уже получены сиквенсы 18S и 28S для всех исследованных родов, дополнительно COI и 16S – для Gorgonolaureus и фактор сплайсинга и АТФ синтаза (splising factor, Atp synthase) – для Baccalaureus (впервые для Ascothoracida). Данные по этим генетическим маркёрам использовались при анализе филогении тантулокарид и текострак. Нами описан новый вид Gorgonolaureus bicornutus (Ascothoracida, Synagogidae) из вод юго-восточного Тайваня, с глубины 227 м (Kolbasov et al., 2015, см. файл с презентацией, Рис. 11). Пять самок были обнаружены в цистах горгонарии Echinogorgia sp. Эти особи принадлежат к роду Gorgonolaureus на основании следующих морфологических признаков: удлиненный и вздутый карапакс с щелевидной апертурой, длинные дорсальные роговидные выросты торакса, торакопод I без базальных филаментов, шипы тельсона рудиментарны. G. bicornutus отличается от других видов рода наличием двух голых дорсальных роговидных выростов на торакомерах 2, 3 и числом семяприемников и массивных щетинок на пятом антеннулярном сегменте. Нами выделены признаки, общие для рода Gorgonolaureus: i) отсутствие базальных филаментов на торакоподе I; ii) 1-3 дорсальных роговидных выроста на торакомерах 1-3; iii) отсутствие развитых проксимальных зубов мандибулы; iv) короткие или рудиментарные шипы тельсона; v) большинство видов – паразиты восьмилучевых кораллов подотряда Halaxonia, но никогда не встречаются на кораллах подотряда Сalcaxonia. Анализ распространения рода и близких ему тксонов показал, что паразиты горгонарий из родов Gorgonolaureus и Isidascus представлены реликтами Тетиса, сохранившимися в Западной Пацифике и Восточной Атлантике, тогда как родственные роды Cardomanica и Thalassomembracis имеют четкое Западно-Атлантическое/Западно-Пацифическое распространение. В ходе глубоководной экспедиции KURAMBIO II, о которой упоминалось ранее, наряду с уникальными представителями Tantulocarida, был собран интересный материал по мешкогрудым ракообразным (Ascothoracida). В Курильском желобе, на абиссальных глубинах 5150-5700 м были обнаружены два вида офиур, заражённые двумя представителями аскоторацид (сем. Ascothoracidae, см. файл с презентацией, Рис. 12). Эти паразиты представляют два новых таксона: один – новый вид Ascothorax rybakovi sp. nov., а другой – новый род и вид Cardiothorax pedri gen. et sp. nov. Это мезопаразиты, живущие в особых изолированных цистах внутри бурс офиур Ophiacantha pacifica (A. rybakovi) и Amphiophiura pacifica (C. pedri). Cardiothorax является новым родом семейства Ascothoracidae, включавшего 2 рода, и отличается от рода Ascothorax по следующим апоморфным признакам: i) отсутствию торакопода 1; ii) меньшим пятым антеннулярным сегментом, слитым полностью с коротким крюком (когтем); iii) отсутствию мелких щетинок у основания крюка пятого антеннулярного сегмента и iv) чрезвычайно длинному вентральному выросту четвёртого абдоминального сегмента. Дополнительно нами на электронном микроскопе (СЭМ) исследован материал из типового местонахождения по роду Parascothorax, также принадлежавшего к семейству Ascothoracidae. Нами не обнаружены реальные морфологические признаки, позволяющие различить роды Ascothorax и Parascothorax. Показано, что способ образования цисты не может рассматриваться как диагностический признак рода Parascothorax, потому что является признаком самого хозяина, формирующего цисту, а не паразита. Кроме того, оседание аскоторацидной личинки на наружный край бурсальной щели является плезиоморфным состоянием по сравнению с проникновением личинки внутрь бурсальной полости, наблюдаемым у других представителей семейства Ascothoracidae, и отражает их эволюционный переход от экзо- к мезопаразитизму. Таким образом, монофилетический род Parascothorax (P. synagogoides) является младшим синонимом рода Ascothorax. Нами установлено, что семейство Ascothoracidae включает роды Ascothorax и Cardiothorax. Род Ascothorax является космополитическим и включает специализированных паразитов, обитающих лишь в одном виде хозяев. Род Cardiothorax, найденный на глубинах 5200-5700 метров, является одним из самых глубоководных представителей Ascothoracida. Фрагменты ткани одного из видов (A. rybakovi) были использованы для выделения ДНК и получения сиквенсов 18S, 28S, COI (впервые для этого семейства), которые привлечены нами для написания рукописи по реконструкции филогении Thecostraca и Tantulocarida. По полученным данным нами подготовлена рукопись (Kobasov, Petrunina, inprep.), которая будет сдана в 2018 г. в номер Deep-SeaResearch, посвящённый исследованиям этой глубоководной экспедиции. Помимо представителей сем. Ascothoracidae, нами были собраны две особи рода Dendrogaster (сем. Dendrogastridae), обитающих в целомической полости морских звёзд Eremicaster crassus (глубины 6200 м и 5700 м), и, скорее всего, представляющих новый вид, так как для этого вида хозяев впервые отмечено заражение мешкогрудыми ракообразными, а все известные виды Dendrogaster характеризуются строгой специфичностью к хозяевам (Вагин, 1976, Grygier, 1991). Несколько экземпляров науплиальных личинок Dendrogaster sp. были использованы для выделения ДНК и получения сиквенсов 18S, 28S, COI. Нами проведена ревизия и получены уникальные сиквенсы (12S, COI, 18S) архебалянидных усоногих родов Conopea и Acasta (Cirripedia, Thecostraca), обитающих в книдариях отрядов Alcyonacea и Antipatharia (Kolbasov et al., 2016). Исследованы морфология домика, оперкулярных табличек, ротовых конечностей, усоножек и пениса. Были выделены 26 морфологических признаков для анализа филогении этих ракообразных. Основываясь на морфологических признаках, становится очевидным, что виды рода Conopea s.l. формируют три группы, ассоциированные с родами Conopea s.s., Acasta и Solidobalanus. С помощью кладистического анализа нами проанализированы родственные связи между видами родов Conopea s.l. и Acasta, обитающими в альционариях. Показано, что балянусы рода Conopea s.s. характеризуются прочным, толстым домиком, с ровным краем оперкулярного отверстия, рострум и карина часто удлинены в базальных частях; ростро-каринальная ось основания часто вытянута и прочно обхватывает стержень коралла; радиусы с вершинами параллельными базальному краю, их сочленовные края зубчатые; скутум с простыми гребнями роста и синусовидным базитергальным углом; базидорсальный вырост пениса развит. Род Conopea s.s. включает 20 эпибионтных видов из тропических и субтропических морей, обитающих на альционациях (горгонариях) и антипатариях. Описаны два новых вида из родов Conopea и Acasta соответственно, приведён определительный ключ для видов рода Conopea s.s. Также в ходе выполнения проекта нами были описаны 8 новых видов усоногих рода Acasta – симбионтов губок (Archaeobalanidae, Cirripedia) из Индо-Вест Пацифики (Yu et al., 2017a, Yu et al., 2017b). В частности, используя комбинированный морфологический и молекулярный подходы в исследовании спонгиобионтов Тайваня и Австралии, мы выявили большое разнообразие видов и обнаружили четыре новых вида, которые морфологически близки к широко распространённому виду Acasta sulcata, представляющему комплекс криптических видов. Морфологические признаки мягких частей усоногих дополнительно исследовались с помощью сканирующей электронной микроскопии. С помощью молекулярных данных нами показано, что подсемейство Acastinae в его нынешнем понимании (по Kolbasov, 1993) является парафилетическим. В ходе реализации проекта нами были созданы уникальные планктонные ловушки (см. файл с презентацией, Рис. 13) и описаны оригинальные методы сбора и фиксации ларвальных стадий Cirripedia, позволяющие оценивать их биоразнообразие и плотность поселений в изучаемых районах (Chan et al., 2016). Для получения планктонных личиночных стадий использовался оригинальный метод светящейся ночной ловушки. Ловушка изготавливается из пятилитровой полиэтиленовой прозрачной канистры со светящимся элементом внутри (стержень заполненный прозрачным силикогелем со светодиодами и батарейкой) и конических пластиковых элементов (крупные конические пробирки с отрезанным дном), которые вмонтированы с помощью эпоксидного клея по окружности канистры. Активно плывущий на свет планктон попадает внутрь через отверстия в зауженной части каждой пробирки, а обратно выплыть уже не может. Ловушка использовалась нами в 2015-2017 гг для сбора планктонных организмов на Тайване и Белом море. Благодаря ей нам удалось собрать планктонные циприсовидные личинки Ascothoracida (родов Baccalaureus и Petrarca). Следует отметить, что на Тайване эти личинки обнаружены впервые. До этого личинки аскоторацид единично обнаруживались в планктонных пробах, нам же удалось за два раза использования ловушки собрать несколько десятков особей этих личинок. Благодаря чему была детально исследована их морфология, а в последствии обнаружены и взрослые стадии этих паразитов в исследуемой акватории. На Белом море эта же ловушка эффективно отлавливала планктонные стадии Facetotecta - других ракообразных, изучаемых нами. Особая эффективность ловушки состоит в использовании светящегося стержня оригинальной конструкции. Светящийся элемент работает бесперебойно несколько дней и на это свечение собираются разнообразные планктонные организмы, обладающие положительным фототаксисом. Использование такого светящегося элемента производится впервые в таких ловушках и существенно повышает их эффективность.