ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
В ходе выполнения предыдущих проектов РФФИ нами впервые были выявлены и описаны эпителиальные и мезенхимные морфогенезы, а также их клеточные механизмы у нескольких видов губок из классов Demospongiae и Homoscleromorpha. Настоящий проект является логическим продолжением предыдущих исследований. В рамках проекта предусматривается детальное изучение эволюционно древнего сигнального механизма Wnt, контролирующего эмбриональные и постэмбриональные морфогенезы через регуляцию пролиферации, миграции и дифференцировки клеток на примере нашего модельного объекта - морской губки Halisarca dujardini (Demospongiae). Для идентификации генов, вовлеченных в функционирование сигнального пути Wnt у H. dujardini будет изготовлена и секвенирована библиотека тотальной кДНК. В ходе выполнения работы будет использован широкий спектр отработанных нами современных методов клеточной и молекулярной биологии (функциональный анализ выявленных генов, путем блокирования трансляции мРНК с помощью морфолино олигонуклеотидов, конъюгированных с пептидом, обеспечивающим эндоцитоз, in situ гибридизация, иммуноцитохимия, световая и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM), методы гистологии, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии), а также биоинформатики (программа САР3, алгоритмы ESTScan и OrthoMCL, пакет BLAST, пакеты программ PHYML, PhyloBayes). Полученные нами результаты на губке будут сопоставлены с функциями сигнального механизма Wnt, описанного для высших многоклеточных животных. Изучение сигнального пути Wnt в ходе жизненного цикла эволюционно примитивных организмов, таких как губки, позволит нам выявить ряд эволюционных и онтогенетических закономерностей, лежащих в основе регуляции морфогенезов у низших Metazoa и их эволюционной значимости.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
2 | 1 января 2013 г.-31 декабря 2015 г. | Роль Wnt сигнального пути в эмбриональных и постэмбриональных морфогенезах губки Halisarca dujardini (Porifera: Demospongiae) |
Результаты этапа: В соответствии с планами на 2014 г., поставленные задачи как научного, так и организационного характера в основном выполнены. Проведены сбор и подготовка экспериментального материала (губки Halisarca dujardini) в период летнего сезона на беломорской станции ЗИН РАН «Картеш» и на морской станции Гетеборгского университета Sven Loven Marine station (Швеция). Там же осуществлены микрохирургические операции, микроинъекции, эксперименты с ингибиторами, фиксация животных и выделение нуклеиновых кислот. Нами получены принципиально новые, не опубликованные ранее данные. Были клонированы фрагменты генов Wnt-лигандов длиной 900-1100 п.н. в транскрипционный вектор с которого синтезированы меченные РНК-зонды к каждому из 10 идентифицированных HdWnt, а также к рецептору Frizzledи вторичному цитоплазматическому мессенджеру Dishevelled. Адаптирована методика проведения гибридизации нуклеиновых кислот insituна губках с целью локализации транскриптов с применением РНК-зондов, меченных дигоксигенином. Изучена экспрессияwnt у интактной H. dujardini. По локализации транскриптов выделено три области экспрессии генов HdWnt: 1- оскулярный домен, охватывающий оскулярную трубку и демонстрирующий экспрессиюHdWntD, 2 - периферический домен, локализованный вдоль границы экзо- и базопинакодермы и экспрессирующий HdWntF, HdWntH и HdWntI, 3 - повсеместную мозаичную экспрессию генов HdWntE, HdWntK и HdWntG в клетках экзопинакодермы и мезохила. Экспрессия wnt в ходе регенерации оценивалась методом гибридизации insitu и сравнивалась с паттернами экспрессии HdWntу интактных губок. Экспрессия HdWntменяется при регенерации части тела H. dujardini. Для большинства генов HdWntэкспрессия изменяется в течение первых 6 часов и сохраняется в таком виде вплоть до 24 часов регенерации. Паттерны экспрессии генов HdWntD, HdWntE и HdWntGне меняются при регенерации по сравнению с интактной губкой. Ни один из этихwnt не экспрессируется в клетках на раневой поверхности. Ген HdWntJ сильно экспрессирован в единичных клетках исключительно на раневой поверхности на протяжении первых 24 часов регенерации. Экспрессия HdWntK наблюдается уже через 6 часов после операции и ограничена краем раны. Через 24 часа транскрипт появляется в периферическом домене – в экзопинакодерме, граничащей с базопинакодермой. Экспрессия HdWntFв течение первых 12 часов регенерации наблюдается мозаично по всей поверхности неповрежденной экзопинакодермы, а через 24 часа после операции, паттерн экспрессии стягивается до периферического домена. Паттерны экспрессии HdWntHи HdWntIв течение первых 24 часов регенерации с помощью гибридизации insituне выявляются. Транскрипты генов HdWntD, HdWntE, HdWntF, HdWntG, HdWntHи HdWntI на уровне, достаточном для детекции, в клетках личинок H. dujardini не выявлены. Большое количество мРНК гена HdWntC равномерно распределено в покровном жгутиковом личиночном эпителии. Гены HdWntJ и HdWntK экспрессируются в виде широкого кольца по экватору личинки, не заходя на задний полюс. Лиганд HdWntL экспрессируется в отдельных группах клеток поверхностного эпителия на заднем полюсе. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".