Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколенияНИР

Structural and functional analysis of proteins, nucleic acids and protein-nucleic acid complexes as the basis for creating synthetic regulators of gene expression and drugs of new generation

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
4 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: Изучаются механизмы взаимодействия макромолекул в составе белок-белковых и белково-нуклеиновых комплексов, образующихся в процессе функционирования клетки. Разрабатываются новые ингибиторы интегразы (ИН) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), для этого изучается механизм ингибирования интеграции производными метиленбисфосфонатов (МБФ), содержащими хлорбензильный заместитель при атоме углерода в Р-С-Р участке. Из всех исследованных соединений только α-амино МБФ оказались неконкурентными ингибиторами ИН и, следовательно, могут представлять интерес как потенциальные ингибиторы ИН в прединтеграционном комплексе. Для оценки влияния мутаций лекарственной устойчивости на активность интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A, доминирующего на территории России, получены и охарактеризованы препараты консенсусной интегразы вируса этого субтипа, содержащие первичные мутации лекарственной устойчивости G118R и Q148K и вторичные компенсаторные замены E138K и G140S, и проведено их сравнение с соответствующими мутантными формами интегразы ВИЧ-1 субтипа В штамма HXB-2. Мутация Q148K практически одинаково снижала активность интеграз обоих субтипов. Ее негативный эффект частично компенсировался вторичными мутациями E138K и G140S. Первичная замена G118R оказывала разное влияние на активность белков субтипов А и В, компенсаторное действие вторичной замены Е138К также зависело от субтипа вируса. Сравнение устойчивости всех полученных мутантов к известным ингибиторам переноса цепи ралтегравиру и элвитегравиру и новому ингибитору XZ-259 из класса дигидро-1Н-изоиндолов показало, что белки обоих субтипов с мутацией Q148K мало чувствительны к ралтегравиру и элвитегравиру, но достаточно эффективно ингибируются XZ-259. Замена G118R незначительно снижала эффективность ингибирования интеграз ралтегравиром и элвитегравиром и не вызывала устойчивости к XZ-259. В рамках исследования свойств и функций малых некодирующих РНК впервые было показано, что 6S-1 и 6S-2 РНК B.subtilis способны специфически ингибировать in vitro транскрипцию модельных промоторов различных генов B. subtilis. Установлено, что обе 6S РНК проявляют сравнимую эффективность ингибирования транскрипции вне зависимости от нуклеотидных последовательностей промоторных элементов выбранных генов и природы стартового нуклеотида. Впервые in vitro продемонстрирован синтез коротких фрагментов РНК (пРНК) на 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis в качестве матриц для транскрипции и определены их нуклеотидные последовательности. Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) изучена морфология агрегатов, образуемых сигма70-субъединицей РНК-полимеразы E.coli и ее мутантными вариантами в различных условиях, при варьировании рН и ионной силы раствора, а также в присутствии различных низкомолекулярных лигандов. Обнаруженный полиморфизм агрегатов позволил предложить новую универсальную модель формирования амилоидных фибрилл. Методом молекулярного клонирования и сайт-специфического мутагенеза в комбинации с аффинной хроматографией получен рекомбинантный белок ядерного экспорта вируса гриппа (NEP), а также ряд мутантных вариантов белка с заменами остатка триптофана 78, предположительно участвующего во взаимодействии с белкомМ1 оболочки вируса. Продемонстрирована высокая способность белка к агрегации. Методами светорассеяния и АСМ изучена морфология образующихся агрегатов, представляющих собой в основном сферические макрочастицы. Исследовано влияние различных факторов (ионной силы, концентрации белка, присутствие различных низкомолекулярных лигандов) на характер агрегации. Показана эффективность низкомолекулярных аналогов иммуногенных пептидов проламинов – субстратов, ингибиторов и аффинного сорбента на их основе для характеристики и идентификации глутамин- и пролинрасщепляющих пептидаз различного происхождения: растительных ферментов папаина, фицина и бромелаина, катепсинов B и L человека и животных, рекомбинантной дипептидилпептидазы IV человека, а также новых катепсинов, пролилолигопептидазы, пролилкарбоксипептидазы и дипептидилпептидазы IV, входящих в состав мультиферментного пищеварительного комплекса насекомых семейства тенебрионид. Продолжаются работы по исследованию белковых комплексов в E.coli. Исследовано взаимное влияние пирофосфатазы (РРазы) и глутаматдекарбоксилазы (GAD) на каталитические параметры фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (FbaB). Было обнаружено, что константы диссоциации образуемых бинарных комплексов РРаза:FbaB и Gad:FbaB лежат в пределах 2-5 мкМ; РРаза существенно улучшает сродство FbaB к субстрату фруктозо-1,6-бисфосфат, снижая константу Михаэлиса с 15 до 2,6 мМ, при этом максимальная скорость реакции практически не изменяется. Выдвинуто предположение о роли обнаруженного комплекса в метаболизме при переходе клеток E.coli на низкоуглеводную диету. Также выявлено, что GAD влияет на параметры FbaB противоположным образом: увеличивает Vmax примерно на порядок, при этом Km практически не изменяется. Получен препарат химически модифицированной FbaB с ковалентно пришитым субстратом, методом масс-спектрометрии идентифицирован сайт модификации (Lys136). Препарат закристаллизован для структурных исследований. Создана панель рекомбинантных молекул, способных к специфическому элиминированию В-клеток и после экспериментов на культуре спленоцитов выбраны наиболее перспективные белки-киллеры. Обнаружено, что цитотоксические молекулы 7MBP-Fc и 12MBP-Fc , представляющей собой пептиды-фрагменты основного белка миелина (МВР) в составе слитных белков с константными фрагментами антител обладают значительным терапевтическим эффектом. Введение данных молекул мышам линии SJL/J, развивающим ЕАЕ, не только эффективно подавляет развитие симптомов ЕАЕ, но и приводит к полному выздоровлению животных после стадии первичного обострения. Продолжены работы по получению рекомбинантного ингибитора серпина камчатского краба РС в дрожжах. Получены генно-инженерные конструкции и определено, что белок экспрессируется. Для детекции наличия белка получены поликлональные антитела из кроличьей сыворотки. Показана возможность увеличить выход ренатурированного серпина из наработанных в E.coli телец включения методом разведения после предварительной очистки на катионообменнике. Рекомбинантный серпин РС, по сравнению с нативным, более эффективно ингибирует трипсин, субтилизин и коллагеназу РС. Продолжено изучение молекулярных основ функционирования эукариотической ДНК-метилтрансферазы Dnmt3а. Выявлены особенности метилирования полуметилированных многосайтовых ДНК-субстратов с различной локализацией метильных групп, объясняющие, как появляется изначальный «рисунок» метилирования ДНК. С привлечением биохимических и спектральных методов получены данные о механизме влияния повреждения ДНК под действием 6-тиогуанина на функционирование Dnmt3a. Исследовали взаимодействие Dnmt3a с ДНК в составе нуклеосомы, в том числе с нуклеосомной ДНК, поврежденной бензо[a]пиреном (B[a]P). Начата разработка димерных бисбензимидазолы DBP(n), (где n – число метиленовых групп в линкере, соединяющие бисбензимидазольные фрагменты, а P – остаток пиперазина) как ингибиторов ДНК-метилтрансфераз. Эти соединения в отличие от изученных ранее DB(n) растворимы в воде. Показано, что они связываются с ДНК. DBP(n) ингибируют метилирование ДНК-дуплексов в низких концентрациях. DBP(n) в концентрации 20 мкМ способны проникать через клеточные мембраны и накапливаться в ядрах фибробластов Ф-977 и клетках рака молочной железы MCF7. В данной концентрации все четыре соединения оказались нетоксичны для клеток. Для создания базы данных (БД) имеющихся маркеров по глиомам был использован SQLight и создан скрипт на языке Python с использованием фреймворка web.py, обеспечивающий извлечение информации из БД и динамическую генерацию HTML страниц. Шаблоны HTML страниц были подготовлены с использованием Twitter Bootstrap. Созданная БД сетевая и не зависит от платформы; запущена на сервере группы структурной биологии факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ по адресу: http://vsb.fbb.msu.ru/glioma/. Проведен подбор биологических маркеров глиом, выбрано 22 гена, сгруппированных в три группы: раковые маркеры, маркеры нейральной дифференцировки и маркеры стволовых клеток. На первом этапе эксперимента для подбора аптамеров выбрано два гена: EGFR – ген рецептора эпидермального фактора роста и PDGFRA – ген рецептора роста тромбоцитов альфа. Синтезирована серия аптамеров и проведен первичный скриниг на культурах клеток. Изучаются механизмы взаимодействия макромолекул в составе белок-белковых и белково-нуклеиновых комплексов, образующихся в процессе функционирования клетки. Определено, что 3’-конец теломеразной РНК H. polimorpha стабилизирован по Sm-независимому механизму. Показано, что мутации, нарушающие структуру ограничивающего элемента теломеразной РНК H. Polimorpha, укорачивают длину теломер в различной степени, а мутация А170С приводит к удлинению теломер. Проверено влияние метилирования ДНК на экспрессию теломеразной РНК рыбы Danio rerio. Выявлен участок 3’-концевого процессинга теломеразной РНК человека. Установлено, что терминатор находится в пределах 2000 оснований от 3’-конца зрелой формы hTR. Для изучения влияния PARP1(2) на репликацию теломер разработаны системы как для подавления, так и для повышения экспрессии этих белков в клетках млекопитающих. Показано, что разрывы цепи ДНК сопряжены с внутренними теломерными повторами. Созданы 48 конструкций, содержащих репрезентативную выборку природных участков инициации трансляции. Создана библиотека репортёрных плазмид для тестирования гипотезы «разгонного участка» мРНК. Проверены 96 культуральных жидкостей почвенных микроорганизмов – потенциальных продуцентов ингибиторов трансляции. Отобраны две культуры для дальнейшего анализа. Проведён сравнительный протеомный анализ штамма дикого типа и штаммов, лишенных модификаций рибосомных белков. Выяснено, что модификация белка S6 рибосомы происходит в стационарной фазе роста культуры клеток бактерий. При модификации наблюдается общее подавление трансляции. Подобраны условия in vitro модификации рибосомного белка S6 рекомбинантным ферментом RimK. Работа выполнена на научном оборудовании, закупленном по Программе развития МГУ: Автоматизированная универсальная станция для высокопроизводительных манипуляций с клетками, белками и нуклеиновыми кислотами, сканер радиоактивности флюоресценции и хемилюминесценции, высокопроизводительный тандемный времяпролетный масс-спектрометр с матричной лазерной десорбцией/ионизацией, высокоскоростной клеточный сортер, лазерный инвертированный флуоресцентный микроскоп с суперразрешением и с системой пробоподготовки.
5 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: а) Выявлены участки альтернативного полиаденилирования, которые могут участвовать в терминации транскрипции гена теломеразной РНК человека и ассоциированного с ней процессинга. Мутационный анализ показал возможность сплайсинг-зависимого процессинга теломеразной РНК человека. Определена внутриклеточная локализация белка hTERP. Оказалось, что он образует специфические околоядерные структуры и защищает клетки от апоптоза в условиях его индукции ДНК-повреждающими агентами. б) Исследован протеом нокаутных штаммов по генам: rlmA, rlmB, rlmC, rlmD, rlmE, rlmF, rlmG, rlmH, rlmI, rlmJ, rlmL, rlmM, rlmN, rsmA, rsmB, rsmC, rsmD, rsmE, rsmF, rsmG, rsmH и rsmJ. Белки, количество которых изменялось, идентифицировали с помощью трипсинолиза и MALDI масс-спектрометрии. в) В рамках разработки новых ингибиторов репликации вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 проводится изучение молекулярных и структурных особенностей взаимодействия вирусной интегразы (ИН) и клеточного белка Ku70, важного для эффективной репликации ВИЧ-1, поэтому комплекс этого клеточного белка с вирусной ИН является новой мишенью для создания противовирусных препаратов. Установлено, что Ku70 связывается с ИН ВИЧ-1; причем это взаимодействие специфично, поскольку с ИН другого ретровируса (PFV) Ku70 не связывается. С помощью специально полученных делеционных мутантов обоих белков показано, что N-концевой домен Ku70 связывается с каталитическим доменом ИН в районе аминокислот 160-220. Взаимодействие С-концевого домена Ku70 с интегразой происходит в районе аминокислот 50-160. г) На примере никующей эндонуклеазы BspD6I разработан подход, позволяющий регулировать активность фермента в заданный момент времени с помощью внешнего сигнала (изменение температуры) за счет использования термочувствительных аналогов субстрата. Сконструированы 13- и 15-звенные немодифицированные синтетические ДНК-дуплексы, которые блокируют активность фермента при 20 °С. Повышение температуры вызывает диссоциацию дуплексов-ингибиторов и приводит к восстановлению ферментативной активности. Предлагаемый подход может быть использован для оптимизации реакции изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи, а также для модулирования активности химерных нуклеаз, применяемых в генной терапии. д) Методом сайт-направленного мутагенеза в комбинации с аффинной хроматографией получен ряд мутантных вариантов белка Е2 (одного из основных компонентов вириона вируса гепатита C) с заменами аминокислотных остатков в сайтах N-гликозилирования. Исследовано влияние произведенных замен на взаимодействие Е2 с белком Е1 в бакуловирусной системе, выявлены ключевые сайты, участвующие в образовании функционального гетеродимерного комплекса Е1-Е2, обеспечивающего полноценную сборку вирусной частицы. е) С целью изучения механизмов агрегации белков методами генной инженерии получен набор плазмидных конструкций, позволивших экспрессировать и выделить ряд мутантных вариантов белка ядерного экспорта вируса гриппа (NEP), в том числе составных белков, содержащих флуоресцентные компоненты. Морфология агрегатов, формируемых некоторыми рекомбинантными белками, исследована методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Предложена усовершенствованная модель формирования амилоидных фибрилл. ж)Показано, что в растворе апоформы KduI существует равновесие между гексамерной и димерной формами. Удаление связанного Zn2+ под действием EDTA, а также инкубация с субстратом G6P сдвигает равновесие в сторону димера. Димерная форма каталитически активна, в то время как гексамер практически неактивен. Исследование кинетики диссоциации KduI показывает промежуточное образование неактивных тетрамеров. Белковые партнеры (РРаза и FbaB) потенцируют диссоциацию KduI до димеров и резко увеличивают активность белка. з) На основе биоинформатического анализа выявлены наиболее активные пролинспецифичные пептидазы (ПСП) в составе пищеварительного ферментного комплекса тенебрионид – дипептидилпептидаза 4 (ДПП4) и аминопролилпептидаза (АПП). Синтезирована серия хромогенных п-нитроанилидных (pNA) и флуорогенных 4-амино-7-метилкумаридных (АМС) дипептидных субстратов общей формулы Х-Pro-Y (X= Ala, Gly, Phe, Lys, Arg, Pro, Gln ; Y=pNA, AMC) для изучения пролинспецифичных пептидаз различного происхождения. Показано, что полученные соединения устойчивы к действию пролилэндопептидаз и расщепляются только ДПП4. и)Разработаны методики синтеза и подробно исследованы физико-химические, биохимические и биологические свойства новых гибридных биоорганических соединений – протеиназ и ингибиторов, иммобилизованных на детонационном наноалмазе; изучено взаимодействие новых гибридных биоорганических соединений in vitro на трансформированных клеточных линиях, исследованы условия их проникновения этих соединений в клетку и их взаимодействие с клеточными структурами к) методом ПЦР в реальном времени проанализирован многочисленный операционный материал образцов глиобластом по онкомаркерам и маркерам стволовости (СД 133). Синхронно высокий уровень экспрессии рецепторов двух факторов роста ЭФР (эпидермального фактора роста) и ФРТ (фактора роста тромбоцитов) коррелирует с высоким уровнем летального исхода для пациентов. На культурах клеток показано, что ДНК-G-квадруплексы проявляют антипролиферативную активность. л) Продолжено исследование молекулярных основ механизма действия эукариотической ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a, ответственной за установления определенного «рисунка» метилирования ДНК. С использованием мутантных форм каталитического домена Dnmt3a и модифицированных субстратов показано, что в самом каталитическом акте и в предшествующей ему стадии конформационной перестройки субстрата участвуют два высоко консервативных остатка Arg. м) Методом молекулярной динамики изучен сегмент стенки РТ рибосомы E.coli, состоящий из нуклеотидных остатков А2058, А2059, m2A2503, G2061, А2062 и С2063 23S рРНК. Показано, что потенциальный сигнал-передающий путь A2058-C2063 ведет себя как динамический ансамбль взаимозависимых конформационных состояний, изменения в котором могут происходить каскадообразно. Осуществлен синтез пептидных аналогов антибиотика харрингтонина.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".