![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
В рамках НИР проводится экспериментальное исследование свойств цитоскелетных белков животных и человека, в том числе свойств белков, определяющих мышечную сократимость (тропомиозина, миозина), и свойств белков микротрубочек, необходимых для клеточного деления и для работы нейронов. В работе применяются уникальные приборы: дифференциальный сканирующий калориметр и флуоресцентный микроскоп с супер-разрешением. С помощью направленного мутагенеза исследуется роль отдельных аминокислотных остатков в структурно-функциональных свойствах изучаемых белков.
Работа продолжающаяся.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
2 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Характеристика структурно-функциональных свойств цитоскелетных белков эукариотических клеток |
Результаты этапа: В отчетный период были продолжены и завершены начатые ранее исследования пространственной структуры связывающегося с актином белка тропомиозина. Недавно в центральной части молекулы тропомиозина (ТМ) были обнаружены два консервативных неканонических остатка – Asp137 и Gly126, нарушающих структуру двойной спирали ТМ в этой области, и было показано, что замена этих остатков на канонические остатки (мутации D137L и G126R) стабилизируют центральную часть молекулы ТМ. Мы провели сравнение структурных и функциональных свойств мутантных препаратов ТМ, несущих такие замены, различными методами. Более того, мы впервые получили препарат мутантного ТМ, несущий обе эти замены в одной молекуле (мутация D137L/G126R). В отчетный период нам удалось показать, что двойная мутация D137L/G126R стабилизирует молекулу ТМ значительно сильнее, чем каждая из одиночных мутаций. Показано, что стабилизация повышает АТРазную активность миозиновых головок при их взаимодействии с актиновыми филаментами, содержащими ТМ, кроме того, увеличивает максимальную скорость скольжения регулируемых тонких филаментов, содержащих ТМ и тропонин, в искусственной подвижной системе (in vitro motility assay) при высоких концентрациях Са2+. Более того, стабилизация ТМ повышает Са2+-чувствительность актин-миозинового взаимодействия, обеспечивающего скольжение тонких филмантов. На основе этих результатов и литературных данных впервые высказано предположение, что физиологические эффекты мутаций в ТМ могут быть обусловлены не только стабилизацией центральной части молекулы ТМ, но и их влиянием на взаимодействия между центральной частью ТМ и определенными участками головки миозина. Было исследовано также влияние мутаций G126R, D137L и D137L/G126R на доменную структуру ТМ, с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с другими методами и подходами. Показано, что двойная мутация D137L/G126R в центральной части ТМ способна стабилизировать не только эту часть молекулы ТМ, но и другие ее части, включая N- и C-концевые домены. Была более подробно изучено взаимодействие белка эукариотической рибосомы Rpl22 с микротрубочками. При помощи TIRF-микроскопии (микроскоп Nikon N-SIM/N-STORM, приобретенный по программе «Развитие МГУ») было показано, что Rpl22, слитый с зеленым флуоресцентным белком и 6-His-тэгом, связывается с микротрубочками и способен к линейной диффузии вдоль них. Для идентификации доменов связывания Rpl22 с микротрубочками получены ДНК-конструкции, кодирующие транкированные мутантные формы белка. Оказалось, что удаление N-концевого фрагмента Rpl22 (1-15 а.о.) не влияет на его взаимодействие с микротрубочками, но удаление С-концевого фрагмента (120-128 а.о.) ингибирует такое взаимодействие. Получена также ДНК-конструкция, кодирующая Rpl22, лишенный одного из центральных доменов: альфа-спирального структурно автономного участка молекулы (88-97 а.о.). Была проведена экспериментальная работа по изучению взаимодействия в клетках белка CLASP2 с мембранами аппарата Гольджи, а также по влиянию этого белка на сборку микротрубочек на мембранах аппарата Гольджи. При экспрессии в клетках Vero белка CLASP2 он не связывался с аппаратом Гольджи, но взаимодействовал с микротрубочками. Однако при одновременной экспрессии белка Arl4a белок CLASP2 начинал связываться с аппаратом Гольджи. Дальнейшая работа предусматривает подробное изучение микротрубочки-связывающей активности мембран аппарата Гольджи после связывания с ними CLASP2 и Arl4a. Была также клонирована кДНК, кодирующая белковый домен GRIP, таргетирующий белки на мембраны аппарата Гольджи, и получена ДНК-конструкция, кодирующая CLASP2, слитый с GRIP-доменом. При экспрессии этой конструкции в клетках Vero слитый белок CLASP2-GRIP действительно направлялся на аппарат Гольджи, но это не приводило к усилению способности мембран аппарата Гольджи организовывать микротрубочки. Таким образом, постоянное прочное связывание CLASP2 с мембранами недостаточно для реализации способности этого белка стабилизировать и организовывать микротрубочки. Были получены также ДНК-конструкции, кодирующие белок COPII-окаймления Sec23, слитый с субъединицей динактина p150, как на N-конце, так и на С-конце молекулы. При экспрессии этих ДНК-конструкций в клетках оказалось, что белок Sec23-p150 связывается преимущественно с везикулярными компартментами, и эти везикулы приобретают способность к быстрым перемещениям по клетке. Белок p150-Sec23 в основном ассоциируется с микротрубочками. Таким образом, показано, что ассоциация p150 (динактина) с Sec23 действительно может способствовать перемещению по клетке везикул раннего везикулярного транспорта (между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи). | ||
3 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Характеристика структурно-функциональных свойств цитоскелетных белков эукариотических клеток |
Результаты этапа: | ||
4 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Характеристика структурно-функциональных свойств цитоскелетных белков эукариотических клеток |
Результаты этапа: Исследован механизм взаимодействия динактина с центросомой в животных клетках. Показано, что белок p150Glued (динактин-1) может связываться с центросомой независимо от остальных компонентов динактина, причем его связывание не зависит от микротрубочек, но обусловлено как N-концевым микротрубочки-ассоциированным доменом, так и вариабельным доменом (137-157 а.о.). Закончено исследование взаимодействия рибосомного белка RPL22e с микротрубочками и показано, что этот белок связывается с микротрубочками с аффинностью, сопоставимой с аффинностью специфических белков, ассоциированных с микротрубочками, причем С-конец белка, содержащий отрицательно заряженные аминокислоты, снижает аффинность RPL22e к микротрубочкам. Методом динамического светорассеяния проведен подробный сравнительный анализ агрегационных свойств двух изоформ изолированных головок миозина (субфрагмент 1 миозина, S1), содержащих разные существенные легкие цепи – А1 и А2, которые различаются наличием в А1 уникального N-концевого 41-членного сегмента. Показано, что в условиях низкой ионной силы S1(A1) подвергается интенсивной агрегации, полностью отсутствующей у S1(A2). Такая необычная агрегация S1(A1) полностью исчезала при формировании стабильных аналогов ключевых интермедиатов АТРазной реакции S1, для которых не наблюдалось никакой разницы в агрегационных свойствах между S1(A1) и S1(A2). Сделан вывод, что такая агрегация S1(A1) обусловлена межмолекулярными взаимодействиями N-концевого сегмента А1 с моторными доменами других молекул S1, которая отражает, по-видимому, внутримолекулярное взаимодействие этого сегмента А1 с моторным доменом миозиновой головки, происходящее в процессе АТРазного цикла. | ||
5 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Характеристика структурно-функциональных свойств цитоскелетных белков эукариотических клеток |
Результаты этапа: Достигнут прогресс в исследовании актомиозинового взаимодействия. Молекулярный механизм сокращения мышц основан на АТФ-зависимом циклическом взаимодействии головок миозина с актиновыми нитями. Головка миозина (S1) состоит из моторного домена, ответственного за гидролиз АТФ и связывания актина, и регулирующего домена, стабилизированного легкими цепями. Существенная легкая цепь-1 (LC1) имеет дополнительную аминокислотную последовательность на N-конце (NTE), и может связываться с актином, образуя, таким образом, дополнительный сайт связывания актина на головке миозина. Мы предположили что при связывании АТР, когда головка миозина отделяется от актина, NTE LC1 может взаимодействовать с моторным доменом миозина. Чтобы проверить эту гипотезу, мы применили метод резонансного переноса флуоресценции (FRET). Для этого мы изготовили рекомбинантные мутанты LC1 по цистеину, которые сначала флуоресцентно пометили 1,5-IAEDANS (донором) в разных положениях в их NTE, а затем ввели в S1; аналог ADP (TNP-ADP), связанный с активным сайтом S1, использовали в качестве акцептора. Результаты показывают, что образование комплекса S1-ADP-BeFx (аналог S1-ATP) значительно уменьшает расстояния от остатков Cys в NTE LC1 до TNP-ADP в активном сайте S1; этот эффект был наиболее выраженным для остатков Cys, расположенных вблизи N-конца LC1. Эти результаты подтверждают концепцию индуцированного АТP взаимодействия N-конца LC1 с моторным доменом миозина. При изучении взаимодействия Sec23/Sec24 везикул с динеин-динактиновым комплексом было обнаружено, что наиболее существенную роль играет белок BicD. При трансляционном связывании его N-концевого фрагмента с Sec23 наблюдали усиленное перемещение везикул и образование их кластера в центре клетки. Показано также, что малая ГТФаза Arl7 (Arl4c) участвует в ассоциации белка CLASP2 с микротрубочками и с аппаратом Гольджи в культивируемых клетках млекопитающих. | ||
6 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Характеристика структурно-функциональных свойств цитоскелетных белков эукариотических клеток |
Результаты этапа: Получены ДНК-конструкции для экспрессии в клетках млекопитающих белка GCC185 (белок мембран аппарата Гольджи, ответственный за связь с микротрубочками), белков Arl4a и Arl4c/Arl7 - малых ГТФаз, участвующих в ассоциации GCC185 с белками микротрубочек. Обнаружили, что клонированная нами короткая изоформа белка Arl7 локализуется преимущественно в ядре клеток. Ее экспрессия в клетках существенно не влияет ни на аппарат Гольджи, ни на систему микротрубочек. Показано, что уровень экспрессии Arl7 в клетках HeLa, Vero и BS-C-1 значительно отличается, причем в клетках HeLa количество этого белка минимально. При действии на клетки HeLa активаторов LXR/RXR рецепторов уровень Arl7 в них повышается в течение 7 суток в несколько раз, но в клетках Vero при таком же воздействии уровень Arl7 не меняется. Повышение уровня Arl7 коррелирует с увеличением числа свободных микротрубочек, нуклеирующихся в цитоплазме клеток. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) исследовали структурные свойства трех изоформ тропомиозина (ТМ), α, β, и γ, которые экспрессируются с разных генов в скелетных мышцах человека. Мы сравнили специфические особенности тепловой денатурации αα-, ββ-, и γγ-гомодимеров ТМ, а также его αβ- и γβ-гетеродимеров. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что термостабильность γγ-гомодимеров ТМ гораздо выше, чем у αα-гомодимеров, термостабильность которых, в свою очередь, гораздо выше, чем у ββ-гомодимеров. При этом оказалось, что стабильность γβ-гетеродимеров ТМ гораздо ниже, чем у γγ-гомодимеров, а по характеру тепловой денатурации γβ-гетеродимеры ТМ коренным образом отличаются как от γγ- гомодимеров, так и от ββ- гомодимеров. В то же время αβ-гетеродимеры ТМ по характеру их тепловой денатурации не слишком отличались от αα-гомодимеров. В ходе этих экспериментов, проведенных методом ДСК, мы попытались выяснить, почему γγ-гомодимеры ТМ намного стабильнее, чем его αα-гомодимеры. Для этого сначала мы сравнили их аминокислотные последовательности и попытались найти те остатки в αα-гомодимерах ТМ, замена которых в γγ-гомодимерах ТМ могла бы приводить к значительной стабилизации молекулы. Нам удалось обнаружить лишь два таких остатка. Один из них – Lys29 в N-концевой части последовательности α-ТМ, который заменен на остаток Gln29 в последовательности γ-ТМ. Присутствие положительно заряженного остатка Lys29 в положении, которое в норме должен занимать гидрофобный остаток, должно было нарушать структуру двойной спирали αα-ТМ, а его замена на незаряженный остаток Gln29 должна была, по нашему предположению, стабилизировать эту структуру в N-концевой части последовательности γγ-ТМ. Другой обнаруженный нами дестабилизирующий остаток – это Gly188 в С-концевой части последовательности α-ТМ, который заменен на остаток Ser188 в последовательности γ-ТМ. Известно, что наличие остатка глицина, отличающегося высокой конформационной подвижностью и крайне низкой способностью к формированию α-спиралей, должно их существенно дестабилизировать, а замена Gly188 на Ser188 должна была, по нашему предположению, стабилизировать структуру двойной αα-спирали в С-концевой части последовательности γγ-ТМ. Для проверки этих предположений мы получили два новых препарата αα-ТМ с мутациями Lys29Gln и Ser186Ala/Gly188Ser, имитирующими такие замены в последовательности γγ-ТМ, и исследовали их тепловую денатурацию методом ДСК. К нашему удивлению, мутация Lys29Gln не оказывала никакого влияния на тепловую денатурацию αα-ТМ, и кривая ДСК для этого мутантного препарата ТМ практически не отличалась от кривой, полученной для αα-ТМ дикого типа. Напротив, двойная мутация Ser186Ala/Gly188Ser, т.е. замена двух остатков, Ser186 и Gly188, расположенных рядом друг с другом в последовательности αα-ТМ, на остатки Ala186 и Ser188, характерные для γγ-ТМ, самым драматическим образом изменяла характер тепловой денатурации αα-ТМ. Эта мутация резко сдвигала тепловой переход, соответствующий плавлению С-концевой части αα-ТМ, в сторону более высокой температуры, делая кривую ДСК для αα-ТМ похожей на кривую, полученную для γγ-ТМ. Таким образом, именно замена остатков Ser186 и Gly188 в αα-ТМ на остатки Ala186 и Ser188 в γγ-ТМ (скорее всего, замена дестабилизирующего остатка Gly188 на остаток Ser188) и является одним из тех главных факторов, которые отвечают за резкую стабилизацию молекулы γγ-гомодимера ТМ (по крайней мере, ее С-концевой части) по сравнению с αα-гомодимером ТМ. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".