| 1 |
28 июля 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Трансляционный аппарат клетки как мишень ферментативной модификации |
| Результаты этапа: Выполнено комплексное исследование того, как различные модификации рРНК бактерий влияют на биосинтез белка в бактериальной клетке. Впервые исследование функции модифицированных нуклеотидов рРНК проводится столь комплексно. Для работы были использованы штаммы, каждый из которых лишен одной из модификаций (16S rRNA m7G527, 16S rRNA m2G966, 16S rRNA m5C967, 16S rRNA m2G1207, 16S rRNA Cm1402, 16S rRNA m4C1402, 16S rRNA m5C1407, 16S rRNA m3U1498, 16S rRNA m2G1516, 16S rRNA m62A1518 и m62A1519, 23S rRNA m1G745, 23S rRNA m5U747, 23S rRNA m6A1618, 23S rRNA m2G1835, 23S rRNA m3Ψ1915, 23S rRNA m5U1939, 23S rRNA m5C1962, 23S rRNA m6A2030, 23S rRNA m7G2069, 23S rRNA Gm2251, 23S rRNA m2G2445, 23S rRNA 2498Cm, 23S rRNA m2A2503, 23S rRNA Um2552). Оказалось, что в оптимальных условиях выращивания только штамм, лишенный гена rlmE растет существенно медленнее дикого типа и именно в этом штамме накапливаются интермедиаты сборки рибосомных субчастиц. Для большинства других штаммов замедление роста и снижение эффективности синтеза белка наблюдалось в условиях суперэкспрессии чужеродного белка. Штаммы, лишенные генов rlmA, rlmB, rlmC, rlmE, rlmF, rlmG, rlmH, rlmI, rlmJ, rlmKL, rlmM, rlmN, rsmA, rsmD, rsmE, rsmH и rsmJ, в отличие от штамма дикого типа могли синтезировать чужеродный белок менее эффективно и только за счет снижения уровня синтеза других белков клетки. Эти опыты говорят о существовании некоторого "запаса прочности" белок-синтезирующего аппарата бактериальной клетки, который оказывается существенно понижен в отсутствии модификаций рРНК. Для одного из нокаутных штаммов, rsmF, наоборот, была обнаружена способность к повышенной эффективности биосинтеза белка. Возможно, данная модификация рибосомы является своего рода ограничивающей эффективность трансляции.
Начато изучение ранее неизученных РНК метилтрансфераз млекопитающих. Клонирован ген предположительной РНК метилтрансферазы WBSCR27. Рекомбинантный белок выделен из клеток бактерий и с его помощью получены поликлональные антитела кролика.
Исследован механизм действия антибиотика амикумацин. Оказалось, что мишенью этого антибиотика является рибосома и ингибируется процесс транслокации мРНК и тРНК. |
| 2 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Трансляционный аппарат клетки как мишень ферментативной модификации |
| Результаты этапа: |
| 3 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Трансляционный аппарат клетки как мишень ферментативной модификации |
| Результаты этапа: Проект посвящен изучению системы модификации аппарата биосинтеза белка.
В 2016 году наша группа занималась изучением предположительных РНК метилтрансфераз млекопитающих. Ген KIAA1456 является одним из двух ближайших гомологов дрожжевой тРНК-метилтрансферазы Trm9. Нашими зарубежными коллегами было предположено, что этот ген может являться опухолевым супрессором (Begley U., et al. EMBO Mol Med (2013) 5, 366–383). Ген предположительной РНК метилтрансферазы KIAA1456 был инактивирован в клеточной линии NIH3T3 на предыдущем этапе проекта. На данном этапе был проведен сравнительный протеомный анализ линии с инактивированным геном KIAA1456 и родительской линии. При инактивации KIAA1456 была понижена экспрессия нескольких белков, относящихся к трансляционному аппарату и системе цитоскелета, и повышена экспрессия нескольких генов, отвечающих за ряд процессов метаболизма. Было также установлено, что экспрессия гена KIAA1456 происходит на достаточно высоком уровне во всех проанализированных тканях мыши, являясь максимальным в печени.
Для исследования фенотипа инактивации этого гена на уровне целого организма было решено провести попытку инактивации этого гена в мышах. В опытах по получению нокаутных по гену KIAA1456 мышей всего было инъецировано 263 яйцеклетки в ходе четырех циклов работы. Из 143 яйцеклеток, успешно прошедших микроинъекцию и подсаженных самкам рецепиентам родилось 19 мышат из которых не менее 11 имели мутантные аллели гена KIAA1456, приводящие к сбою рамки считывания. Полученные линии мышей с инактивированным геном KIAA1456 были использованы для скрещивания и получения потомства поколения F2 несущего гомозиготные инактивированные аллели исследуемого гена.
Было показано, что KIAA1456 не нужен для модификации субстратов его дрожжевого гомолога тРНКSec, тРНКGlyUCC и тРНКGlnUUG мыши.
Для определения субстратов и партнеров белка KIAA1456 были созданы несколько генетических конструкций и клеточных линий. Была создана конструкция, содержащая химерный ген HA-KIAA1456-P2A-GFP, содержащий HA-аффинный эпитоп для выделения белка и ген зеленого флюоресцентного белка в рамке с KIAA1456 для отбора клеток, содержащих данную экспрессионную конструкцию. Полученная конструкция была встроена в лентивирусный вектор, проведена сборка вирусоподобных частиц и инфицирование ими клеток NIH3T3.
Кроме лентивирусного вектора, для создания клеточных линий со встроенным геном химерного белка HA-KIAA1456 мы также использовали вектор на основе транспозазы SB100X (усовершенствованная мутагенезом транспозаза sleeping beauty). Ген HA-KIAA1456 под контролем доксициклин-регулируемого промотора был встроен в кассету, окруженную инвертированными повторами, узнающимися транспозазой. Также удалось получить 3 линии клеток с добавлением последовательности, кодирующей HA-таг, непосредственно к гену KIAA1456 в его природном положении в геноме мыши. Правильность вставки проверили методами ПЦР, секвенирования и вестерн-блотинга с антителами на HA-таг.
Ген, кодирующий предположительную РНК-метилтрансферазу WBSCR27 входит в состав участка генома человека, делетированного при наследственном заболевании синдром Вильямса. На данном этапе выполнения проекта был проведен анализ уровня экспрессии гена WBSCR27 в различных органах мыши. Оказалось, что экспрессия WBSCR27 достаточно высока в нескольких органах, и практически отсутствует в сердце и мозге.
Для получения линий мышей с инактивированным геном WBSCR27 яйцеклетки мышей были инъецированы мРНК Cas9 и сгРНК к гену WBSCR27 и подсажены псевдобеременным самкам мышей. Всего было инъецировано 265 яйцеклеток в течение нескольких экспериментов. Из 12 родившихся мышат семь содержали различные мутации в гене WBSCR27. В результате скрещивания получено пять линий мышей, несущих различные аллели инактивированного гена WBSCR27.
Для определения партнеров и возможных субстратов белка WBSCR27 необходимо было разработать метода аффинного выделения этого белка. Как и в случае KIAA1456 в вектор, встраиваемый в геном с помощью транспозазы SB100X, был введен ген химерного белка HA-WBSCR27 под контролем доксициклин-активируемого промотора. Также, для подтверждения внутриклеточной локализации белка, определенной ранее с помощью антител к WBSCR27, была создана генетическая конструкция mKate2-WBSCR27. Эта конструкция была встроена в геном клеточной линии NIH3T3 с помощью транспозонного вектора. В обеих клеточных линиях WBSCR27 локализуется и в цитоплазме и в ядре, но в ядре интенсивность больше. Эта локализация в целом соответствует ранее полученным с помощью анти-WBSCR27 антител данным для природного WBSCR27 без довесков.
Созданная линия клеток экспрессирующих ген химерного белка HA-WBSCR27 при индукции доксициклином была использована для проверки условий аффинного выделения. Оказалось, что в условиях выделения оказывается возможным очистить химерный белок. Масс-спектрометрический анализ позволил однозначно идентифицировать зону с молекулярной массой около 27 кДа соответствующую HA-WBSCR27. |
| 4 |
1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Трансляционный аппарат клетки как мишень ферментативной модификации |
| Результаты этапа: 1. С потенциальной РНК метилтрансферазой KIAA1456 взаимодействуют белки TRMT112, 14-3-3γ и 14-3-3ε.
2. С потенциальной РНК метилтрансферазой WBSCR27 не совыделяется никаких белков. Начата работа по сшиванию возможных белковых партнеров WBSCR27 с помощью формальдегида для их выделения.
3. Не выявлено РНК, взаимодействующих с потенциальной РНК метилтрансферазой KIAA1456 по результатам использования метода PAR-CLIP.
4. Не выявлено РНК, взаимодействующих с потенциальной РНК метилтрансферазой WBSCR27, по результатам использования метода PAR-CLIP.
5-10. Поскольку в план работ были внесены коррективы, изменился и список полученных результатов.
- Показано, что ген KIAA1456 сильнее всего экспрессируется в мозжечке мыши.
- Клетки линии NIH 3T3 гетерогенны по локализации белка KIAA1456. Локализация KIAA1456 в одной субпопуляции ядерная, в другой цитоплазматическая.
- Антитела к WBSCR27 не имеют требуемой специфичности.
- Получена линия клеток с природным уровнем экспрессии гена WBSCR27-HA, содержащая С-концевой НА пептид.
-Получена линия мышей с инактивацией гена NSUN7 с помощью сдвига рамки считывания в участке гена, соответствующем активному центру.
-Получена линия мышей с присоединенным к N-концу NSUN7 HA-пептидом в природном гене NSUN7.
-Показана возможность иммунопреципитации HA-NSUN7 гибридного белка из семенников мыши.
-Антимикробный пептид клебсазолицин ингибирует биосинтез белка.
-Антимикробный пептид клебсазолицин останавливает рибосому после синтеза трипептида.
-Антимикробный пептид клебсазолицин защищает нуклеотиды пептидилтрансферазного центра и пептидного туннеля рибосомы от химической модификации.
-Замены A2058G, A2058U,A2059C,A2059G,,U2584C,U2609A и U2609G в 23S рРНК приводят к устойчивости к клебсазолицину.
|
| 5 |
1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. |
Трансляционный аппарат клетки как мишень ферментативной модификации |
| Результаты этапа: 1. Определено, что внутриклеточная локализация KIAA1456 не зависит от фазы клеточного цикла.
2. В результате нескольких попыток микроинъекций, не рождено жизнеспособных мышей со сдвигом рамки считывания в области гена, соответствующей активному центру KIAA1456.
Создана линия мышей со вставкой НА довеска в KIAA1456 мыши.
3. Создана плазмиды для экспрессии в клетках E. coli KIAA1456 и TRMT112 одновременно. Осуществлена экспрессиия в клетках E. coli KIAA1456 и TRMT112 одновременно.
4. Получена линия мышей со сдвигом рамки считывания в области гена, соответствующей активному центру WBSCR27
Получена линия мышей со вставкой НА довеска в WBSCR27.
5. Из-за низкого выхода сшивки не оказалось возможным определить партнеров WBSCR27, сшивающихся с этим белком. Получены линии клеток с экспрессией генов белков BirA и WBSCR27-BirA. Определены белки, специфически биотинилирующиеся WBSCR27-BirA, но не BirA.
6. Созданы и отсеквенированы библиотеки РНК семенников мышей дикого типа и нокаутов по гену NSUN7 после бисульфитной конверсии. Проводится биоинформатический анализ полученных результатов.
7. С помощью препаративной иммунопреципитации НА-NSUN7 из экстракта семенников мыши выявлены белки-партнеры NSUN7.
8. Из-за низкого включения в РНК при максимальной переносимой концентрации азацитидина не представляется возможным определить РНК, совыделяющуюся с НА-NSUN7 после инъекций азацитидина мышам.
|
