ИСТИНА

Изучались структура и свойства эндогенного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба (серпина PC). С помощью аффинной хроматографии и гель-фильтрации выделен гомогенный ингибитор РС, изучены кинетические параметры взаимодействия ингибитора РС с различными сериновыми протеиназами. Исследовано действие серпина РС на С1s (С1 эстеразу системы комплемента человека), обнаружено его сходство с ингибитором С1 плазмы крови, константа ингибирования составила (2.02±0.71)x10-7M. Исследовано взаимодействие серпина PC с опухолевыми клетками, и выделены его потенциальные субстраты. Исследовались два вида культивируемых опухолевых клеток: HeLa и HT-1080. На первые проявляется цитотоксическое действие ингибитора, в то время как для вторых было показано его отсутствие. В культуральной жидкости HeLa была обнаружена, выделена и охарактеризована цистеиновая протеиназа. Протеолитическая активность в культуральной жидкости HT-1080 была так же проанализирована и была выделена соответствующая протеиназа, которая, как и ожидалось, не взаимодействует с ингибитором PC. Были получены нуклеотидная и белковая последовательности серпина РС; соответствие структуры которого с таковой, определенной секвенированием гена, было подтверждено методом масс-спектрометрии. Анализ аминокислотной последовательности показал, что профермент содержит 418 аминокислотных остатка, рассчитанная молекулярная масса 46,3 кДа. N-концевая последовательность, определенная для нативного белка и таковая, транслированная с полученной кДНК, совпадают. Идентифицирован важный функциональный участок-реакционная петля ингибитора. Получен рекомбинантный ингибитор в Е. coli, который экспрессируется в виде телец включения. Установлено, что изменение температуры экспрессии, тепловой и осмотический шок, варьирование концентрации индуктора, а так же использование других штаммов (Rosetta(DE3) и BL21(DE3)pLysS) не приводят к экспрессии растворимого рекомбинантного ингибитора PC в E. coli. Подобран способ очистки и последующей ренатурации, проведено сравнительное ингибирование нативным и рекомбинантным ингибитором. Была начата и продолжается работа по освоению более совершенной системы, P. Pastoris, где он был получен во внутриклеточном виде. Так же была получена кроличья поликлональная антисыворотка на серпин PC.