ИСТИНА

Среди РНК-содержащих вирусов растений, клостеровирусы имеют наиболее крупные и сложно устроенные геномы, кодирующие 9-11 белковых продуктов. Репликаза клостеровирусов закодирована в перекрывающихся генах 1а и 1b. Экспрессия генов 1а и 1b клостеровируса желтухи свеклы (ВЖС) происходит с помощью +1 фреймшифтинга и протеолитического разрезания полипротеинов-предшественников 1а и 1аb. Эти белки имеют структуру N—PCP—MTR—INS—HEL—C и N—PCP—MTR—INS—HEL—POL—C, соответственно (РСР, домен цистеиновой протеиназы; MTR, домен метилтрансферазы; INS, неконсервативный спейсер; HEL и POL, домены хеликазы и РНК полимеразы). Выщепление лидерного 66К белка ВЖС происходит автокаталитически под действием PCP. Белок 1а подвергается дальнейшему процессингу, в результате чего in vivo образуются крупные фрагменты MTR и HEL. Судьба INS в клетке, как и активность, ответственная за его выщепление, не выяснены, и картина экспрессии и созревания клостеровирусной репликазы остается неполной. Фундаментальный интерес представляет также проблема взаимодействия белковых компонентов в составе сложного репликативного комплекса ВЖС. При клостеровирусной инфекции в клетках образуются мультивезикулярные комплексы, в мембранах которых обнаруживаются белки MTR и HEL. Однако, неизвестно, какие домены белков 1а и 1аb служат для заякоривания в мембранах и участвуют в цитопатогенном механизме индукции везикул. Настоящий проект ставит своей целью изучение процессинга полипротеина-предшественника репликазы ВЖС, картирование доменов вирусных белков, служащих для заякоривания на клеточных мембранах, и вирусных детерминант индукции везикулярных репликативных сайтов.

Протестированы в растениях Nicotiana benthamiana экспрессирующие конструкции на основе вектора pLH1000 (под контролем 35S промотора), в которых ген маркера GFP слит с протяженными участками гена репликазы 1а вируса желтухи свеклы (ВЖС), кодирующими домены метилтрансферазы (МТ) - CR-2 (83 кДа) и домены лидерной протеиназы (РСР) - МТ - CR-2 (149 кДа). При агроинокуляции растений данные конструкции не индуцировали экспрессию маркерного белка GFP, определяемую с помощью конфокальной микроскопии. Для дальнейшего тестирования образования "репликативных платформ" ВЖС и процессинга полипротеинов 1а МТ-CR-2 и РСР-МТ-CR-2 будет (a) продолжена отработка метода экспрессии in vivo, и (b) использована экспрессия Т7 транскриптов, кодирующих фрагменты гена 1а, в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика. С этой целью получены конструкции на основе вектора pGEM T7-МТ-CR-2 и T7-РСР-МТ-CR-2, пригодные для получения целевых транскриптов. Проведен исчерпывающий делеционный анализ "глобуло-образующего" домена CR-2 белка 1а (позиции 1305-1494 1а). Установлено, что "минимальный" фрагмент CR-2, необходимый для формирования глобул in vivo, состоит из 61 аминокислоты (TKVFLLCGFLPVFVRKCVALCVPGDMATYARFLEYGVDDLFFLGRSVNSIKNYLCVVAAGLVDSR, позиции 1370-1433 в белке 1а) и несет на N-конце потенциальный трансмембранный сегмент VFLLCGFLPVFV. Внесение в этот сегмент точечных замен гидрофобных остатков а.к. на нейтральные остатки глицина и серина приводило к изменению фенотипа при экспрессии слитного белка с GFP - при конфокальной микроскопии наблюдалось диффузное свечение на периферии клетки, а образование глобул полностью прекращалось. Проведен электронно-микроскопический (ЭМ) анализ клеток растений, содержащих CR-2-индуцируемые глобулы. В области ядра обнаружены скопления везикул, окруженных общей мембраной (диаметр ~1 мкм). Методом иммуноспецифической ЭМ (с моноклональными антителами к GFP и конъюгатом антивидовых антител с коллоидным золотом) показано, что значительная часть метки ассоциирована с мембранами мультивезикулярных комплексов.