| Результаты этапа: 1) Проведено исследование роли протеинкиназ эукариотического типа в регуляции адаптивного ответа цианобактерий на тепловой стресс и недостаток железаа) Серин-треониновые (Ser/Thr) протеинкиназы являются ключевыми компонентами сигнал-передающих путей в клетках эукариотов. Недавние исследования показали, что Ser/Thr протеинкиназы присутствуют также и у некоторых прокариотов. Однако их роль в передаче сигнала у прокариотов остаётся мало изученной. Нами изучено влияние теплового стресса (42оС, 30 мин) на Ser/Thr-фосфорилирование белков у Synechocystis sр. PCC 6803 (Synechocystis). С помощью фосфорилирования белков in vitro в растворимой фракции и их последующего анализа с помощью двумерного гель-электрофореза и авторадиографии установлено, что температурный стресс приводит к значительному изменению интенсивности Ser/Thr-фосфорилирования белков. Выявлено 7 белков, которые являются субстратами для Ser/Thr киназ. Эти белки были идентифицированы с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Идентифицированные белки принадлежат к нескольким функциональным группам: ферменты основного метаболизма (метионил-тРНК синтетаза, большая субъединица RUBISCO, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, фактор элонгации трансляции Tu, тРНК дельта-2-изопентенилпирофосфат-трансфераза), белки общего стрессового ответа (белок теплового шока GRPE и малый шаперонин GroES), а также белок Slr1270 с неизвестной функцией.В геноме Synechocystis идентифицировано 12 генов, кодирующих Ser/Thr протеинкиназы, и на предыдущем этапе работы нами создана коллекция мутантов с инсерционной инактивацией всех этих генов. Белковые экстракты индивидуальных мутантов были исследованы на Ser/Thr-киназную активность. В качестве внешнего стандарта использовали экспрессированный в клетках E.coli и очищенный с помощью аффинной хроматографии белок GroES. Обнаружено, что мутанты с отсутствием одной из трёх протеинкиназ, SpkC, SpkF или SpkK, не способны фосфорилировать белок GroES in vitro. Введение в клетки мутантов с инактивацией генов spkC, spkF или spkK рекомбинантных плазмид, содержащих дикий аллель соответствующего гена, приводило к восстановлению способности клеток фосфорилировать белок GroES. Полученные данные указывают, что протеинкиназы SpkC, SpkF и SpkK последовательно взаимодействуют между собой и осуществляют фосфорилирование белка GroES с помощью каскадного механизма.Результаты работы опубликованы в журнале «DNA Research».б) Показано, что у цианобактерии Anabaena 7120 в адаптивный ответ на дефицит железа вовлечены Ser/Thr протеинкиназа Pkn22, а также гибриды Ser/Thr протеинкиназ и сенсорных гистидинкиназ Pkn41 и Pkn42 (Xua et al., 2003; Cheng et al., 2006). У Synechocystis идентифицировано 12 генов Ser/Thr протеинкиназ и 47 генов гистидинкиназ. Проведенный нами биоинформатический анализ показал, что только одна из этих гистидинкиназ, Hik29, проявляет значительную гомологию с белками Pkn41 и Pkn42 Anabaena 7120. Известно, что у цианобактерий белок IsiA вовлечен в различные стрессовые ответы и играет важную роль в адаптации клеток к дефициту железа. При этом уровень экспрессии гена isiA увеличивается в 100-1000 раз при голодании по железу и служит удобным индикатором недостатка железа в клетках Synechocystis. Молекулярно-генетические механизмы индукции гена isiA дефицитом железа остаются неизвестными. В задачу нашей работы входило изучение экспрессии гена isiA с помощью ПЦР в реальном времени в зависимости от ионов железа в среде роста у 12 мутантов Synechocystis с инактивацией генов Ser/Thr протеинкиназ, а также у мутанта с инактивацией гена гистидинкиназы Hik29. Установлено, что ни один из исследованных нами генов не вовлечен в регуляцию экспрессии гена isiA у Synechocystis.2) Проведен функциональный анализ гена pfsR, предположительно вовлеченного в регуляцию системы депонирования ионов железа и адаптации клеток к световому стрессуСогласно опубликованным данным, ген pfsR, кодирующий репрессор транскрипции семейства TetR, негативно контролирует гены бактериоферритинов (bfrA и bfrB), которые депонируют двухвалентные ионы железа, индуцирующие образование высокотоксичного гидроксильного радикала (Jantaro et al., 2006). В цитируемой работе показано, что мутант с инактивацией гена pfsR характеризуется повышенной устойчивостью к световому стрессу и пониженной чувствительностью к голоданию по железу. Однако предварительное изучение мутанта PfsR-Ins из нашей коллекции с инактивацией гена pfsR, проведенное на предыдущем этапе выполнения проекта с помощью ДНК-микроэррей анализа, не обнаружило у него изменения транскрипции генов bfrA и bfrB. Ген pfsR входит в состав кластера генов sll1393-pfsR-slr1501-slr1113. Нами установлено, что ген pfsR негативно регулирует гены slr1501 и slr1113, функция которых неизвестна.В отчетном периоде нами было продолжено исследование роли гена pfsR в регуляции адаптивного ответа клеток Synechocystis на стрессовые воздействия. Нами были подтверждены результаты ДНК-микроэррей анализа с помощью Нозерн-блот гибридизации. Установлено, что содержание транскриптов генов bfrA и bfrB не различается в клетках штамма дикого типа и мутанта PfsR-Ins. Гены slr1501 и sll1393 экспрессируются у штамма дикого типа на очень низком уровне, и их транскрипты не выявляются с помощью Нозерн-блот гибридизации, тогда как у мутанта эти гены дерепрессированы. Физиологический анализ показал, что рост мутанта PfsR-Ins не отличается от роста штамма дикого типа, как в стандартной среде, так и в среде без железа. Кроме того, при повышенной интенсивности света рост и пигментный состав клеток (каротиноиды, хлорофилл и фикобилины) были сходными у штамма дикого типа и мутанта.Для доказательства того, что фенотип мутанта PfsR-Ins обусловлен инсерционной инактивацией гена pfsR, а не дополнительными мутациями во вторичных сайтах, был проведен комплементационный анализ. С этой целью на основе мутанта был сконструирован штамм TpfsR с восстановленной структурой и функцией гена pfsR. С помощью метода ОТ-ПЦР в реальном времени установлено, что у штамма TpfsR экспрессия генов slr1501 и slr1113 осуществляется на очень низком уровне, как и в клетках дикого типа. Эти данные подтверждают вывод о том, что ген pfsR негативно регулирует гены slr1501 и slr1113, транскрибируемые относительно него в противоположном направлении. Таким образом, наши результаты указывают на то, что ген pfsR не играет критической роли в регуляции гомеостаза железа у Synechocystis. Не исключено, что противоречие между нашими данными и данными, опубликованными ранее (Jantaro et al., 2006), может быть обусловлено генетическими различиями между штаммами дикого типа, использованными для получения мутантов, и/или различиями в структуре мутантов. Этот вопрос требует дальнейшего изучения.3) Проведен структурно-функциональный анализ генов, вовлеченных в контроль гомеостаза ионов железа с участием высокоаффинных систем транспорта (транспортеры сидерофоров) На предыдущем этапе исследований в геноме Synechocystis был идентифицирован кластер из 26 генов, 14 из которых кодируют белки-гомологи компонентов систем транспорта сидерофоров у бактерий. Гены изучаемого кластера могут быть организованы в опероны и, следовательно, могут быть функционально связаны и подвержены координированной регуляции. С помощью метода ОТ-ПЦР в составе кластера были выявлены следующие опероны: exbB-exbD-fhuA2 и fecE-fecB1. Интересно, что у Synechocystis гены fecC и fecD, непосредственно предшествующие генам fecE и fecB1, не входят с ними в состав одного оперона, тогда как у E. coli все гены системы транспорта дицитрата железа составляют единый оперон fecABCDE (Miethke, Marahiel, 2007). Показано, что гены fhuA3, fecB3 и fecB4 на правой границе кластера не организованы в оперон, несмотря на то, что транскрибируются в одном направлении и разделены небольшими нетранслируемыми участками.Сконструирован делеционно-инсерционный мутант с инактивацией генов exbB и tonB, являющихся гомологами известных бактериальных генов, которые кодируют компоненты периплазматического белкового комплекса, необходимого для функционирования систем транспорта сидерофоров. Был исследован рост этого мутанта в зависимости от содержания в среде ионов железа и их хелаторов – ЭДТА и лимонной кислоты. С этой целью использовали 4 варианта измененной стандартной среды: 1) без добавления железа (следы железа), 2) без добавления железа и ЭДТА, 3) без добавления железа, ЭДТА и лимонной кислоты и 4) без ЭДТА, но с ионами железа и 200-кратным избытком лимонной кислоты. В отличие от многих цианобактерий, у Synechocystis 6803 ЭДТА повышает биодоступность железа (Shcolnick et al., 2007). Лимонная кислота является единственным компонентом синтетической среды, который может играть роль сидерофора – переносчика железа в клетки цианобактерии с помощью предполагаемой специфической транспортной системы, зависимой от функции генов exbB и tonB. Установлено, что жизнеспособность штамма дикого типа и мутанта на порядок снижается при росте в среде без железа, ЭДТА и лимонной кислоты. При этом никаких значимых различий между штаммами при их росте во всех исследованных средах не выявлено. Можно полагать, что цитрат не подавляет активность системы FutABC (основной системы транспорта ионов железа) in vivo, либо в клетках цианобактерии функционирует еще одна система транспорта железа, не зависящая от генов exbB и tonB. Кроме того, не исключено, что в среде роста отсутствуют специфические сидерофоры, которые транспортируются системой ExbB-TonB. Таким образом, необходимы дополнительные исследования для выяснения возможного участия генов exbB и tonB в контроле высокоаффинных систем транспорта железа.Ранее нами установлено, что дефицит железа индуцирует экспрессию трёх регуляторных генов, pcrR, pchR1 и pchR2, которые кодируют транскрипционные факторы семейства AraC/XylS. Эти гены входят в состав изучаемого кластера генов и для выяснения их роли в регуляции гомеостаза железа у цианобактерий были сконструированы мутанты с их инсерционной инактивацией. С помощью метода ПЦР в реальном времени проведен сравнительный анализ экспрессии всех генов кластера у штамма дикого типа и этих трёх мутантов. Показано, что у штамма дикого типа недостаток железа индуцирует регуляторные гены pcrR, pchR1 и pchR2, а также большинство структурных генов, за исключением гена fecB4 и генов sll1203 и sll1204 с неизвестной функцией. Такая индукция служит косвенным указанием на участие генов кластера в контроле гомеостаза железа. Ни у одного из мутантов не выявлено отличий от штамма дикого типа в экспрессии структурных генов независимо от наличия ионов железа в среде роста. Вместе с тем, в присутствии железа, у мутантов существенно увеличена экспрессия одного или двух других регуляторных генов. Полученные результаты позволяют заключить, что гены pcrR, pchR1 и pchR2 являются компонентами единой регуляторной сети, при этом гены pcrR и pchR2 негативно регулируют друг друга, а также негативно регулируются геном pchR1. Белки, кодируемые генами pcrR, pchR1 и pchR2 гомологичны и поэтому нельзя исключить, что они функционально взаимозаменяемы. Для выяснения их роли в регуляции других генов был сконструирован и исследован мутант с инактивацией всех трёх регуляторных генов. У тройного мутанта при недостатке железа не обнаружено значимых отличий от штамма ДТ в индуцируемой экспрессии структурных генов кластера, которые, следовательно, не регулируются генами pcrR, pchR1 и pchR2 в данных условиях. Между тем в присутствии железа у мутанта выявлена общая тенденция снижения экспрессии структурных генов кластера. Это позволяет предполагать, что регуляторные гены pcrR, pchR1 и pchR2 участвуют в модуляции внутриклеточного пула железа.4) Исследование роли хлорофилла а и альфа-токоферола в обеспечении структуры и функционировании фотосинтетического аппаратаУ оксигенных фотосинтетических организмов геранилгеранилредуктаза участвует в биосинтезе хлорофилла и токоферолов. У этих организмов токоферолы представлены в основном альфа-токоферолом, который играет важную роль в защите мембранных липидов от перекисного окисления, индуцируемого активными формами кислорода, а также в защите фотосистемы II от фотоингибирования синглетным кислородом. Нами установлено, что у Synechocystis инактивация гена chlP, кодирующего геранилгеранилредуктазу, приводит к накоплению геранилгеранилированного хлорофилла вместо его фитилированного аналога, а также к неспособности клеток синтезировать альфа-токоферол (Shpilev et al., 2005). Комплексный биохимический и биофизический анализ мутанта показал, что он содержит функциональные фотосистемы I и II, однако неспособен к фотоавтотрофному росту из-за нестабильности и быстрой деградации фотосинтетических пигмент-белковых комплексов даже в условиях умеренного освещения. Поскольку эффекты накопления геранилгеранилированного хлорофилла и отсутствие альфа-токоферола могут взаимно накладываться, необходимо вычленить роль каждого из них в стабилизации фотосинтетического аппарата в процессе адаптации клеток к свету. С этой целью был сконструирован мутант, неспособный синтезировать альфа-токоферол в результате инактивации гена hpt, кодирующего гомогентизатфетилтрансферазу – первый фермент на пути биосинтеза токоферолов. Отсутствие токоферолов у мутанта было подтверждено с помощью биохимического анализа. Установлено, что в отличие от chlP-мутанта, способного расти только фотомиксотрофно, htp-мутант растет фотоавтотрофно, как и штамм дикого типа. На следующем этапе работы планируется проведение комплексного сравнительного анализа этих двух мутантов. 5) Обобщены литературные и собственные данные по основным системам регуляции экспрессии генов у цианобактерий в ответ на стрессовые воздействия: низкие и высокие температуры, солевой, гиперосмотический, окислительный стресс, дефицит микроэлементов, свет высокой интенсивности. Описаны системы восприятия клетками света. Представлена функциональная характеристика известных двухкомпонентных систем регуляции, серин-треониновых протеинкиназ эукариотического типа, сигма-субъединиц РНК-полимеразы, ДНК-связывающих транскрипционных факторов. Проанализированы разные механизмы восприятия стрессовых сигналов, включая изменения степени сверхспирализации ДНК при различных стрессовых воздействиях. |
