| Результаты этапа: В рамках проекта исследована серия из восьми аптамеров, состоящих из G-квадруплексного, дуплексного и петлевого блоков. Аптамеры представляют собой различные комбинации структурных блоков аптамеров 31-ТВА и NU172. Функциональная активность серии аптамеров к тромбину была охарактеризована в прошлом году, на данном этапе были исследованы структурные аспекты аптамеров: тип структуры и термическая стабильность.
С помощью спектроскопии кругового дихроизма был определен тип структуры аптамеров: шесть из восьми аптамеров являются антипараллельными G-квадруплексами, а аптамеры ajj и aja являются параллельными G-квадруплексами. Увеличение температуры приводит к изменению формы спектров, что отражает индуцированные конформационные переходы. Ожидаемым переходом было "плавление" - постепенный переход от G-квадруплекса к неупорядоченной форме, однако, мы наблюдали и другие переходы, например антипараллельного G-квадруплекса в параллельный G-квадруплекс. Температуры конформационных переходов находятся в диапазоне от 32°С до 49°С, наблюдается корреляция между определенными температурами и общим числом гуанинов в G-блоках.
Была найдена корреляция между термической стабильностью и функциональной активностью аптамеров к тромбину. Наибольшей функциональной активностью обладают аптамеры 31-ТВА, NU172, jaa и jja. Температуры конформационных переходов G-квадруплексов этих аптамеров составляют 37-50°С, а дуплексных блоков - 54-59°С. Остальные аптамеры обладают значительно более низкой функциональной активностью. У аптамеров aaj и jaj температуры конформационных переходов G-квадруплексов ниже на 10°С и составляют 32-34°С. Аптамеры ajj и aja - параллельные G-квадруплексы, что объясняет их низкую функциональную активность.
Изучение функциональной активности аптамеров показало, что они разделены на три группы: 1) аптамеры NU172 и jaa обладали наибольшей активностью, концентрационная зависимость была нелинейной; 2) аптамеры 31-ТВА и jja обладали меньшей активностью, в отличие от NU172, концентрационная зависимость линейная; 3) остальные аптамеры имеют низкую активность.
В ходе выполнения работ по моделированию структуры аптамера NU172 был предложен подход по анализу последовательностей содержащих кандидатные участки на образование G-квадруплексов. Были предложены топологии аптамеров и отобрана та, которая удовлетворяет экспериментальным данным. Был разработан прототип программного обеспечения, позволяющего моделировать структуры ДНК со сложной топологией на основе известных структур заготовок-модулей. Структурная устойчивость предложенных моделей была оценена моделированием молекулярной динамики. Предложена модель-победитель и оценена устойчивость G-квадруплексного модуля в отсутствии катиона калия. |
| Результаты этапа: В рамках выполнения проекта предложена серия новых ДНК-аптамеров комбинированием структурных элементов известных аптамеров. Турбидиметрическим/энзиматическим методом показан тип ингибирования и оценены константы ингибирования тромбина для аптамеров 31-ТВА (j) и NU172 (a) и комбинаций их структурных модулей — дуплекса, G-квадруплекса и соединяющих петель, обозначенных как «ааа»6 соответственно. Функциональная активность аптамеров оценена также в коагуляционных тестах на плазме крови человека. В функциональных тестах исследуемая серия аптамеров разделилась на три группы: 1) аптамеры NU172 (ааа) и jaa обладали наибольшей активностью, концентрационная зависимость была нелинейной; 2) аптамеры 31-ТВА (jjj) и jja обладали меньшей активностью, в отличие от NU172, концентрационная зависимость линейная; 3) остальные аптамеры имеют низкую активность.
Исследование структуры серии аптамеров методами спектроскопии кругового дихроизма и УФ-спектроскопии в условиях повышения температуры (эксперименты по "плавлению") позволило выяснить особенности взаимодействия структурных модулей в аптамерах. Шесть из восьми аптамеров являются антипараллельными G-квадруплексами, а аптамеры ajj и aja являются параллельными G-квадруплексами. Увеличение температуры приводит к изменению формы спектров, что отражает индуцированные конформационные переходы. Ожидаемым переходом было "плавление" - постепенный переход от G-квадруплекса к неупорядоченной форме, однако, мы наблюдали и другие переходы, например антипараллельного G-квадруплекса в параллельный G-квадруплекс.
Родственные аптамеры имеют разный тип G-квадруплексов и разные конформационные переходы при нагревании. Объяснить этот феномен можно спецификой последовательности нуклеотидов аптамеров, а именно длиной G-повторов. Оба аптамера с параллельным G-квадруплексом содержат 6 гуанинов подряд, при этом ajj с повторами 2-2-2-6 при нагревании претерпевает конформационный переход, в то время как aja с повторами 2-3-3-6 термически стабилен. Можно предположить, что длина G-повтора является определяющей в данном случае. Аптамер jja с повторами 2-2-3-3-4 образует параллельный G-квадруплекс при нагревании. Для остальных аптамеров с короткими повторами, 2-2-2-2-2, 2-2-2-2-4 и 2-3-3-2-2, преобладающей формой является антипараллельный G-квадруплекс. Температуры конформационных переходов аптамеров находятся в диапазоне от 32°С до 49°С, наблюдается корреляция между определенными температурами и общим числом гуанинов в G-блоках.
Была найдена корреляция между термической стабильностью и функциональной активностью аптамеров к тромбину. Наибольшей функциональной активностью обладают аптамеры 31-ТВА и NU172. Температуры конформационных переходов G-квадруплексов этих аптамеров составляют 37-46°С, а дуплексных блоков - 54-57°С. Аптамеры jaa и jja также обладают высокой функциональной активностью, а температуры конформационных переходов G-квадруплексов составляют 41-50°С, а дуплексных блоков - 54-59°С. Остальные аптамеры обладают значительно более низкой функциональной активностью. У аптамеров aaj и jaj температуры конформационных переходов G-квадруплексов ниже на 10°С и составляют 32-34°С, в то время как Тпл. дуплексных блоков примерно на том же уровне - 51-58°С. Аптамеры ajj и aja - параллельные G-квадруплексы, что объясняет их низкую функциональную активность.
Методами молекулярного моделирования были построены модели возможных структур модульных аптамеров 31-ТВА и NU172. В ходе выполнения работ по моделированию структуры аптамеров был предложен подход по анализу последовательностей содержащих кандидатные участки на образование G-квадруплексов. Были предложены топологии аптамеров и отобрана та, которая удовлетворяет экспериментальным данным. Был разработан прототип программного обеспечения на суперкомпьютерах, позволяющего моделировать структуры ДНК со сложной топологией на основе известных структур заготовок-модулей. Структурная устойчивость предложенных моделей была оценена моделированием молекулярной динамики. Предложена модель-победитель и оценена устойчивость G-квадруплексного модуля в отсутствии катиона калия. 3Д-структура аптамеров указывает на значительное влияние петель на структуру фармакофора за счет стэккинга с модульными элементами.
Еще один способ моделировать структуру и функциональную активность G-квадруплексных аптамеров к тромбину - использовать катионы, координируемые внутри G-квадруплекса. Из данных литературы известно существование комплексов с К+, Na+, NH4+, Ba2+, Sr2+, Mn2+. Все перечисленные катионы, кроме Mn2+, координируются внутри G-квадруплекса, снимая электростатическое отталкивание между диполями гуанинов. Mn2+ связывается с фосфатными группами аптамера в его малых бороздках. В 2016 году было показано, что хотя все эти катионы стабилизируют антипараллельный G-квадруплекс, функциональной активностью обладают только комплексы с К+ и Na+. Эффект был показан на минимальном G-квадруплексе HD1, а также модульных аптамерах 31-ТВА и NU172. Показано, что дуплексный модуль стабилизирует структуру аптамера, в результате чего его функциональная активность исчезает при больших концентрациях катионов, чем в случае HD1. Однако, топология аптамера NU172, обладающего повторами гуанинов 2-3-3-2-2, меняется с увеличением ионной силы и концентрации сильных координирующих катионов, таких как Ba2+ и Sr2+. В спектрах КД наряду с антипараллельным G-квадруплексом появляется пик со сходной интенсивностью, соотнесенный с параллельным G-квадруплексом.
Для выяснения причин исчезновения функциональной активности аптамеров был прведен анализ известных 3Д-структур комплексов аптамера HD1 с катионами металлов: К+, Na+, Sr2+ и Mn2+. Оказалось, что функционально активные конформации аптамера в комплексе с катионами калия и натрия имеют практически идентичную структуру. В случае комплексов с катионами стронция и марганца наблюдаются искажения структуры G-квадруплекса за счет изменения степени планарности G-квартетов и их поворота друг относительно друга. Эти изменения приводят к искажению конформации ТТ-петель, отвечающих за узнавание тромбина, что и приводит к потере функциональной активности.
Таким образом, в рамках выполнения проекта было продемонстрировано, что G-квадруплекс выступает каркасом для формирования правильной конформации узнающих петель в аптамерах. Эта конформация является результатом тонкого баланса нековалентных взаимодействий, который может изменяться несколькими способами: 1) добавление дополнительного структурного модуля в некоторых случаях увеличивает функциональную активность на порядок; 2) координируемые структурой катионы могут как усиливать, так и понижать функциональную активность аптамеров.
3.6 Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем
Идея модульной сборки аптамеров оригинальна, не использовалась ранее для конструирования ДНК-аптамеров. В настоящее время в литературных источниках нет данных о способе влияния дополнительных фрагментов на активность фармакофора. Нами впервые была показана ключевая роль петель как модуляторов активности аптамера.
3Д-структура аптамеров 31-ТВА и NU172 ранее была неизвестна. Для моделирования структуры был создан специальный алгоритм построения возможных структур и отбора наиболее стабильных из них для суперкомпьютеров. Аналогов такого алгоритма нет.
В ходе выполнения работ была впервые изучена возможность создания новых аптамеров не перебором библиотек олигонуклеотидов, а направленным конструированием аптамеров из структурных единиц. Впервые показано существование модулей - комбинации структурных единиц, обладающей неаддитивной функциональной активностью. Изучена термическая стабильность структурных элементов серии новых ДНК-аптамеров к тромбину. Впервые показаны необычные конформационные переходы, например, переход антипараллельного G-квадруплекса в параллельный. Впервые показано, что температуры конформационных переходов, определенные при разных длинах волн КД-спектроскопией одинаковы в случае единичного конформационного перехода и различаются в случае наличия нескольких конформационных переходов.
Впервые изучена корреляция структура-функция для комплексов G-квадруплексных ДНК-аптамеров с разными катионами. Показано, что координация катиона влияет на конформацию G-квартетов, которая, в свою очередь, изменяет конформацию узнающих петель аптамера. Таким образом, катионы, координируемые аптамерами, оказывают аллостерическое влияние на функциональную активность аптамеров.
Комплексный подход позволил добиться качественно нового уровня понимания функционирования ДНК-аптамеров к тромбину. |
