Изучение структуры и функций капсидных белков, вирусоподобных и химерных частиц вирусов растений для создания адъювантов нового поколенияНИР

Structure and functions of plant virus capsid protein, virus-like and chimeric particles for new type adjuvants development

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 6 августа 2014 г.-31 декабря 2014 г. Изучение структуры и функций капсидных белков, вирусоподобных и химерных частиц вирусов растений для создания адъювантов нового поколения.
Результаты этапа:
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Изучение структуры и функций капсидных белков, вирусоподобных и химерных частиц вирусов растений для создания адъювантов нового поколения.
Результаты этапа:
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Изучение структуры и функций капсидных белков, вирусоподобных и химерных частиц вирусов растений для создания адъювантов нового поколения.
Результаты этапа: Проведен сравнительный анализ иммуностимулирующих свойств вирусов растений и ВПЧ, полученных на их основе, с адъювантами, используемыми в лабораторной практике и в лицензированных вакцинах. Продемонстрировано, что вирусы растений и ВПЧ обладают сравнимыми адъювантными свойствами с неполным адъювантом Фрейнда и минимум в 10 раз эффективнее, чем полиоксидоний и гидроксид алюминия. Показано, что адъювантные свойства вирусов растений и ВПЧ всего лишь в 2 раза ниже, чем у полного адъюванта Фрейнда. С помощью метода непрямого иммуноферментного анализа определено соотношение антител к целевому антигену и к адъюванту (СЧ ВТМ или ВПЧ ВМАльт), в крови иммунизированных животных. В обоих случаях титры антител к целевому антигену превышали титры антител к адъюванту. С помощью методов флуоресцентной и электронной микроскопии показана возможность формирования комплексов СЧ-ХВК целевым антигеном. Продемонстрировано, что целевой антиген сохраняет свою антигенную специфичность в составе комплекса с СЧ-ХВК. С помощью метода спектрофлуориметрии определено предельное количество целевого антигена, способного адсорбироваться на поверхности СЧ-ВТМ (10 мкг антигена на 50 мкг СЧ) и СЧ-ХВК (5 мкг антигена на 50 мкг СЧ). Предварительные опыты по токсичности показали безопасность вирусов растений и ВПЧ. Таким образом, можно сделать вывод, что спиральные вирусы растений и ВПЧ различной формы, полученные на их основе, являются эффективными и безопасными адъювантами. Созданный искусственный химерный вирус позволил получить антитела к труднодоступному флоэмно-ограниченному вирусу картофеля, которые использовали как для выяснения локализации вируса в клетке, так и для массовой диагностики вирусной инфекции картофеля в поле. Исследование динамики развития инфекции показало, что вначале вирус локализуется в клеточных ядрышках. Заполнив ядрышки, вирус накапливается в ядре, образуя вначале плоские слои с псевдо-кристаллической организацией, а затем регулярные сотовые структуры. Накапливаясь в больших количествах в ядре, вирус вызывает разрывы ядерной мембраны и выходит в цитозоль. В основном вирус размножается в клетках флоэмы. Упаковка РНК в икосаэдр и локализация созданного вируса в клетке определяется белком оболочки вируса картофеля. Белок оболочки (БО) вируса оспы сливы (Plum pox virus, PPV) содержит универсальный эпитоп 94/96DRDVDAG100/102 (УЭ), который, как считалось, экспрессирован у всех изолятов этого вируса. Сэндвич-вариант непрямого иммуноферментного анализа (Triple antibody sandwich ELISA, TAS-ELISA) с моноклональными антителами 5В, специфичными к этому эпитопу, является самым надежным и повсеместно используемым иммунохимическим методом диагностики PPV. Однако, аминокислотные замены в УЭ могут отрицательно влиять на связывание антител 5В и, тем самым, снижать достоверность результатов иммунохимической диагностики PPV. Целью работы в 2016 году было изучение вариабельности УЭ среди изолятов различных штаммов PPV и анализ возможного влияния аминокислотных замен на распознавание УЭ антителами 5В в TAS-ELISA и вестерн-блоте. Сопоставление последовательностей УЭ у изолятов PPV, депонированных в GenBank и из нашей коллекции, с данными о реактивности этих изолятов с антителами 5В показывает, что R95G (замена аргинина на глицин), V97I (валина на изолейцин) и D100N (аспарагиновой кислоты на аспарагин) не препятствуют взаимодействию антител 5В с УЭ. Мутация D96E играет, по-видимому, ключевую роль в нераспознавании УЭ антителами 5В. Возможно, этот результат объясняется большей длиной боковой цепи глутаминовой кислоты (Е, -CH2-CH2-COOH) по сравнению с боковой цепью аспарагиновой кислоты (D, -CH2-COOH). Применение методов триптофановой флуоресценции и кругового дихроизма позволило сделать вывод, что вторичная и третичная структура мутантных вариантов белка оболочки в составе химерных частиц ВТМ-М2е-cys, ВТМ-М2е-ser и ВТМ-М2е-ala практически не отличается от вирионов вируса табачной мозаики (ВТМ) дикого типа. Динамическое лазерное светорассеяние в препаратах показало, что частицы ВТМ-M2е-ala и ВТМ-M2е-ser, образуют агрегаты, в 2-3 раза превышающие размер аналогичных комплексов частиц ВТМ-M2е-сys и ВТМ дикого типа. Измерение дзета-потенциала продемонстрировало, что частицы ВТМ-М2е-cys и ВТМ дикого типа имеют слабый отрицательный поверхностный заряд, в то время как поверхность ВТМ-M2е-ala и ВТМ-M2е-ser была практически незаряженной. Таким образом, гипотеза о фосфорилировании частиц ВТМ-M2е-ser не подтвердилась. Предварительные результаты MALDI-TOF спектроскопии показывают, что рекомбинантные белки оболочки не содержат значимых посттрансляционных модификаций. Электронная микроскопия клеток мезофилла зараженных системных листьев доказала, что жесткие палочковидные частицы ВТМ-М2е-cys и ВТМ-М2е-ser накапливаются в цитоплазме в виде агрегатов параллельных трубчатых структур без липидной мембраны. Меньшее количество частиц было диффузно распределено в центральной вакуоли. Основная часть вирионов ВТМ-М2е-ala располагалась в цитоплазме, при этом упомянутые агрегаты не были обнаружены; вакуоль содержала очень незначительное количество частиц. В отличие от вирионов ВТМ дикого типа, не удалось выявить ни одну из разновидностей химерные частиц в хлоропластах. Диаметры частиц ВТМ-М2е-cys, ВТМ-М2е-ser в цитоплазме превышали диаметр ВТМ-М2е-ala. В агрегатах и вакуолях диаметр частиц был заметно меньше, чем у равномерно распределенных вирионов. Методом спектроскопии кругового дихроизма (КД) в дальнем ультрафиолетовом диапазоне проведено сравнительное изучение оптических свойств белков оболочки (БО) трех гибких спиральных потексвирусов в составе вирионов и в свободном состоянии - вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт), вируса аукуба мозаики картофеля (ВАМК) и Х-вируса картофеля (ХВК). Показано, что спектр КД вирионов ВМАльт аналогичен ранее полученному спектру КД вируса мозаики папайи (ВМПап), но заметно отличается от спектра вирионов ВАМК, сходного своими основными характеристиками со спектром КД Х-вируса картофеля (ХВК), который имеет аномально низкую для альфа-спиральных белков молярную эллиптичность. Гомологичное моделирование структуры БО в составе вирионов ВМАльт, ВАМК и ХВК на основе известных структур высокого разрешения для вирионов и вирусоподобных частиц потексвирусов ВМПап и вируса мозаики бамбука. показало, что структура основной (коровой) части БО для всех трех вирусов практически идентична. Вместе с тем сравнение аминокислотных последовательностей БО различных потексвирусов и предсказание неструктурированных участков в их составе указывает на вероятную корреляцию аномалий в спектрах КД вирионов с наличием в БО неупорядоченных N-концевых участков. Для выявления новых неканонических функций белка оболочки (БО) гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) получены химерные тобамовирусы, в геноме которых ген собственного БО заменен на ген БО ВШМЯ дикого типа или его мутантные варианты. Методом ПЦР в реальном времени определено влияние БО ВШМЯ на экспрессию целого ряда хозяйских генов растений N.benthamiana, отвечающих за защитные реакции растения.
4 10 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. Изучение структуры и функций капсидных белков, вирусоподобных и химерных частиц вирусов растений для создания адъювантов нового поколения.
Результаты этапа:
5 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Изучение структуры и функций капсидных белков, вирусоподобных и химерных частиц вирусов растений для создания адъювантов нового поколения.
Результаты этапа: Разработана новая рекомбинантная вакцина против ротавирусной инфекции на основе антигенов ротавируса (АГ РВ) и вирионов вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт), которые выполняют роль эффективного и безопасного адъюванта. Созданы два варианта препарата кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции, имеющие разный состав рекомбинантных белков – антигенов. Вакцинный препарат 1 (ВП1) содержал антигены первой группы (АГ1) и состоял из антигенных детерминант белков капсида рготавируса VP4 и VP6. Вакцинный препарат 2 (ВП2) включал в себя антигены второй группы (АГ2) и состоял из двух рекомбинантных белков, несущих антигенные детерминанты белков капсида ротавируса VP5, VP7 и VP8. Препараты кандидатной вакцины, содержащие вирионы ВМАльт и рекомбинантные антигены ротавируса А охарактеризованы методами электронной микроскопии и анализа траекторий наночастиц, в том числе определено их агрегационное состояние. Методом иммуноэлектронной микроскопии с использованием коммерческой поликлональной антисыворотки к ротавирусу А подтверждена антигенная специфичность АГ РВ в составе двух вакцинных препаратов ВП 1 и ВП 2. На лабораторных животных было проведено сравнительное исследование иммуногенности рекомбинантных вакцинных белков – антигенов ротавируса в составе вакцинных препаратов, содержащих вирионы ВМАльт. Наибольшие титры антител регистрировались после третьей иммунизации вакцинными препаратами ВП1 (1/100 000) и ВП2 (1/110 000). Подобран оптимальный состав кандидатной вакцины, в котором доза АГ РВ составляла 10 мкг, и оптимальное соотношение АГ – вирионы ВМАльт 1:10. Продемонстрировано, что большая часть антител вырабатывается на целевые антигены, а не на вирионы ВМАльт, используемые в качестве адъюванта. Проведено сравнение иммуностимулирующих свойств вирионов ВМАльт в составе кандидатных вакцин с адъювантами, используемыми в лабораторной практике и лицензированных вакцинах (неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия). Продемонстрировано, что вирионы ВМальт вызывают более высокие титры антител к целевому антигену по сравнению с гидроксидом алюминия и обладают сравнимыми адъювантными свойствами с неполным адъювантом Фрейнда. Показано, что в случае применения нативных вирионов ВМАльт в качестве адъюванта происходит одновременная индукция как клеточного, так и гуморального иммунного ответа, что крайне важно для получения эффективного протективного иммунитета. Были проведены предварительные эксперименты по изучению токсикологических свойств препаратов кандидатной вакцины и её компонентов. Установлено, что исследуемые препараты кандидатной вакцины и ее компоненты не обладают токсичными свойствами. В результате исследований по Проекту 2017 разработана новая кандидатная рекомбинантная вакцина против ротавирусной инфекции на основе антигенов ротавируса А человека и вирусов растений, которые выполняют роль эффективных и безопасных адъювантов. Получены рекомбинантные антигены ротавируса А человека. Исследованы антигенная специфичность, физико-химические свойства, иммуногенность и безопасность вакцинных препаратов. Созданы два варианта препарата кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции, имеющие разный состав антигенов. Показано, что иммуногенность обоих препаратов кандидатной вакцины сравнима. Для выбора оптимального состава новой вакцины необходимы исследования по изучению протективной активности полученных препаратов. На основании полученных результатов планируется проведение доклинических испытаний кандидатной вакцины. Посттрансляционные модификации, в частности гликозилирование, являются важным механизмом регуляции функциональной активности белков. Известно, что N-конец белка оболочки (БО) вируса оспы сливы (Plum pox virus, PPV) штамма D О-гликозилирован N-ацетилглюкозамином по остаткам серина и треонина T19, T24, T40, T41, T53 и S65. Другие штаммы вируса в этом отношении не изучены. Между тем, количество остатков треонина и серина в N-конце БО у изолятов штамма W (PPV-W) вдвое превышает их количество у PPV-D. Их локализация также существенно отличается. Молекулярная масса БО PPV-W, определенная методом электрофореза в полиакриламидном геле, на 4-5 кДа превышала рассчитанную по аминокислотному составу, указывая на возможность посттрансляционных модификаций БО PPV-W. В данной работе впервые изучены степень гликозилирования, природа углеводного компонента и локализация сайтов гликозилирования в БО PPV штамма W посредством матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным разделением (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. С этой целью из зараженных листьев N. benthamiana получен очищенный препарат изолята 1410 штамма W, содержащий преимущественно полноразмерный БО в составе вирусной частицы. Посредством обработки денатурированного вирусного препарата трипсином с последующим разделением пептидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии получен N-терминальный фрагмент молекулы БО (аминокислоты 1 - 93). Для дальнейшей фрагментации N-концевого пептида проведена его обработка химотрипсином и пепсином. Спектры фрагментации проанализированы с помощью программы Mascot с учетом возможного гликозилирования серинов и треонинов N-ацетилглюкозамином. Показано, что от 5 до 9 остатков серина и треонина в N-конце БО PPV-W могут быть посттрансляционно модифицированы N-ацетилглюкозамином. Впервые, в дополнение к известным сайтам гликозилирования, удалось обнаружить гликозилирование S85 и, возможно, T67. С использованием экспериментальной системы, созданной при выполнении Проекта 2017, в данной работе, впервые показано, что белок оболочки (БО) гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) способен выполнять неструктурные функции: ген белка оболочки (БО) гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и его делеционного мутанта способны эффективно замещать ген БО тобамовируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ) в контексте генома ВПЖТ на различных стадиях вирусной инфекции. Ранее мы показали, что удаление С-концевого участка БО ВШМЯ увеличивает патогенность химерного вируса, но не оказывает значительного влияния ни на структуру белка, ни на его поверхностные свойства по сравнению с БО ВШМЯ дикого типа. Методом электронной микроскопии на срезах зараженных листьев выявлены гибкие, зачастую агрегированные вирусные частицы, имеющие аномально низкую толщину – ~10 нм в сравнении с толщиной вирусных частиц, формируемых тобамовирусом дикого типа или химерным тобамовирусом, которая составляет ~20 нм. Характеристики этих частиц (морфология и параметры) сходны с характеристиками нитевидных спиральных вирусов и предполагаемой невирионной транспортной формой вирусного генома – рибонуклеопротеидными (РНП) комплексами, формируемыми in vitro транспортными вирусными белками и вирусными РНК (параметры, склонность в агрегации). Впервые показана роль С-концевого участка БО ВШМЯ для правильной сборки вириона и возможность эффективной инфекции, в том числе и системного транспорта по растению, генома химерного тобамовируса в составе детектируемого in vivo РНП-комплекса. Проведен сравнительный полуколичественный протеомный анализ изменений в профилях экспрессии белков в растениях, инфицированных тобамовирусом дикого типа (дтВПЖТ) и в растениях, инфицированных химерным тобамовирусом (ВПЖТ(БОВШМЯ) и его вариантом с мутантным БО ВПЖТ(ΔС-БО ВШМЯ). В целом, клеточный ответ на инфекцию тобамовирусом дикого типа значительно разнообразнее, что может указывать на различие в механизмах взаимодействия вирус-клетка с участием этих двух БО. Интересно, что при инфекции химерным вирусом содержание белков, вовлеченных в энергетический обмен клетки, оказалось заметно выше. Проведенный сравнительный анализ транскриптомов растений, инфицированных дтВПЖТ, ВПЖТ(БОВШМЯ) и БО ВПЖТ(ΔС-БО ВШМЯ), на ранних сроках инфекции согласуется с полученными протеомными данными, а именно инфекция растений химерным вирусом и химерным вирусом с мутантным БО отличаются от тобамовирусной инфекции, во-первых, профилем дифференциально экспрессируемых генов и ,во-вторых, значительно менее богатым репертуаром клеточных генов, экспрессия которых стимулируется при заражении.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".