![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
В проекте планируется исследование взаимодействия нативных и модифицированных комплексов фотосистем (ФС) 1 и 2 с экзогенными донорами и акцепторами электрона с целью выяснения механизмов внутрибелкового прямого и обратного переноса электронов, а также определения кинетических и термодинамических характеристик реакций переноса зарядов в реакционных центрах ФС 1 и ФС 2. Первой задачей проекта является исследование эффективности взаимодействия различных искусственных акцепторов электрона с пигмент-белковым комплексом ФС 1 в ответ на его возбуждение единичными лазерными вспышками. В качестве объектов исследования предполагается использовать комплексы ФС 1 из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 дикого типа и мутантного штамма menB, содержащего в сайте связывания хинонного акцептора А1 производные бензо- и нафтохинонов с различными редокс-потенциалами, а также комплексы, содержащие различное число железо-серных акцепторов электрона. В качестве внешних акцепторов электрона будут использованы метилвиологен (МВ) и водорастворимые производные нафтохинонов. Кроме этого, в качестве акцепторов электрона предполагается использовать парамагнитные молекулы (стабильные нитроксильные радикалы), взаимодействие которых с ФС 1 удобно регистрировать по изменению интенсивности сигналов ЭПР, обусловленных восстановлением радикалов. Планируется также определить константы скоростей реакций переноса электрона между кофакторами ФС 1 и внешними акцепторами, найти константы равновесия этих реакций, а также константы связывания акцепторов с комплексом ФС 1. Предполагается выполнить кинетическое моделирование кинетики прямых и обратных реакций переноса заряда во всех типах комплексов ФС 1. Актуальность данной задачи определяется тем, что имеющихся в настоящее время термодинамических данных (редокс-потенциалы кофакторов переноса электрона в ФС 1) недостаточно для определения эффективности взаимодействия кофакторов ФС 1 с внешними акцепторами и донорами электронов, поскольку скорости электрон-транспортных процессов определяются не только энергетическими характеристиками редокс-кофакторов и искусственных медиаторов, но и стерическими факторами, определяющими доступность акцепторов и доноров к электронным переносчикам ФС 1. Другой важной задачей настоящего проекта, тесно примыкающей к предыдущей, является изучение взаимодействия вышеперечисленных типов комплексов ФС 1 с экзогенными акцепторами электронов при освещении непрерывным светом. Необходимым этапом на пути к реализации данной задачи является сравнение эффективности восстановления окисленного реакционного центра Р700+ комплекса ФС 1 экзогенными донорами электронов, например, восстановленными формами 2,6-дихлорфенолиндофенола и N,N,N’,N’-тетраметил-p-фенилендиамина. Подбор оптимальных условий для эффективного донирования электрона на фотоокисленный первичный донор P700+ важен для корректного анализа выяснения механизма взаимодействия комплексов ФС 1 с кислородом при непрерывном освещении, которое может сопровождаться образованием активных форм кислорода. Актуальность данного исследования определяется тем, что до сих пор не вполне выяснена природа редокс-кофакторов ФС 1, с которых происходит перенос электрона на кислород с последующим образованием активных форм кислорода. Второй важной задачей проекта является сравнительное исследование нативных и модифицированных препаратов ФС 2, лишенных марганцевого кластера, осуществляющего светозависимое разложение воды. Предполагается исследование взаимодействия искусственных доноров электрона - синтетических Mn-содержащих редокс-активных соединений (наноразмерных аморфных Ca-Mn оксидов) - c редокс-активным тирозином YZ или непосредственно с фотоокисленным первичным донором электрона Р680+. Эти синтетические аналоги природного Mn-кластера позволяют реконструировать светозависимое разложение воды препаратами ФС 2, лишенными Mn-кластера, что является необходимым этапом на пути к созданию стабильных и функционально-активных аналогов комплексов ФС 2, способных к высокоэффективному светозависимому выделению молекулярного кислорода. Актуальность этого направления исследований определяется тем, что комплекс окисления воды ФС 2, как известно, является наиболее уязвимым звеном в цепи переноса электронов от воды к НАДФ, потеря активности которого приводит к подавлению фотосинтеза. Создание модифицированных комплексов ФС 2, обладающих высокой устойчивостью к повышенной температуре и различным химическим агентам, станет важным шагом на пути к решению проблемы искусственного фотосинтеза. Еще одной задачей проекта, связанной с выяснением молекулярного механизма переноса электрона в ФС 2, является исследование светозависимого восстановления экзогенных акцепторов электрона. В проекте предполагается исследование взаимодействия препаратов ФС 2 с различными акцепторами, включая производные хинонов и окисленные формы цитохромов типа с. Планируется выявить условия, при которых будет осуществляться перенос электрона с первичного хинонного акцептора QA не только на природный вторичный хинонный акцептор QB, но и на экзогенные водорастворимые акцепторы электрона. Непосредственное донирование электронов с фотовосстановленного первичного акцептора QA (минуя QB) на экзогенные акцепторы электрона необходимо для создания эффективных и стабильных преобразователей солнечной энергии в электрическую форму, поскольку сайт связывания QB является существенно более лабильным, чем сайт связывания QA. В этом случае представляется возможность осуществления светозависимого переноса электрона с ФС 2 на неорганические полупроводники с участием водорастворимых природных акцепторов электрона. Решение сформулированных выше задач важно для детального анализа донорно-акцепторных свойств белков-преобразователей обоих типов (ФС 1 и ФС 2). Выяснение механизмов взаимодействия фотосинтетических реакционных центров с внешними донорами и акцепторами является важной предпосылкой для создания искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию, в том числе осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода.
The interaction of native and modified complexes of photosystems I (PS I) and II (PS II) with exogenous electron donors and acceptors is the research objective of this project; we aim to clarify the mechanisms of forward and back intraprotein electron transfer, as well as to determine the kinetic and thermodynamic characteristics of the charge transfer reactions in the reaction centers of PS I and PS II. The study of the efficiency of PS I complex interaction with a variety of artificial electron acceptors in response to a single laser flash excitation is the first objective of the project. PS I complexes from the wild-type and mutant menB strain of cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 , containing derivatives of benzo- and naphthoquinones with different redox potentials in the binding site of quinone acceptor A1, as well as complexes containing different number of iron-sulfur electron acceptors will be used as the objects of this study. Methylviologen (MV) and water-soluble derivatives of naphthoquinones will be used as external electron acceptors. In addition, paramagnetic molecules (stable nitroxyl radicals), whose interaction with PS I is easy to register by the EPR signal intensity changes, caused by radical reduction due to their interaction with PS I, will be tested as the electron acceptors interacting with PS I. We expect to determine the rate constants of electron transfer reactions between PS I cofactors and external acceptors, to estimate the equilibrium constants of these reactions, as well as the constants of acceptor binding to the pigment-protein complex. Kinetic modelling of forward and back electron transfer reactions in all types of PS I complex is planned. The relevance of this research is justified by the fact that currently available thermodynamic data (redox potentials of electron transfer cofactors) is not enough to determine the efficiency of interaction of the protein cofactors with external electron donors and acceptors, as the overall rate of the electron-transport processes is determined not only by energy characteristics of PS I and artificial mediator, but also by steric factors determining the accessibility of donors and acceptors to redox-cofactors of PS I. Another important task of this project, closely related to the one described above, is to study the interaction of the above types of PS I complexes with exogenous electron acceptors under continuous illumination. A necessary step on the way to accomplish this task is to compare the efficiency of PS I reduction by exogenous electron donors, e.g. reduced forms of 2,6-dichlorophenol and N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine. The choice of optimal conditions for effective electron donation to the photooxidised primary donor P700+ is important for elucidation of the mechanism of PS I complexes interaction with oxygen under intensive illumination, which can be accompanied by the formation of reactive oxygen species. This research objective is relevant since the nature of PS I redox cofactors, which can donate the electron to oxygen, with following reactive oxygen species formation, is still not fully understood. Another important objective of the project is the comparative study of the ability of native and modified (lacking manganese cluster) PS II samples to perform light-dependent water splitting. We plan to study the interaction of the artificial electron donors - synthetic Mn-containing redox-active compounds (nanoscale amorphous Ca-Mn oxides) - with redox-active tyrosine YZ or directly with the photooxidised primary electron donor P680. These synthetic analogues of natural Mn-cluster restore the light-dependent water splitting by PS II samples lacking Mn-cluster, which is a necessary step towards the design of stable and functionally active modified PS II complexes capable of highly efficient light-dependent production of molecular oxygen. The relevance of this research is due to the fact that PS II is known to be the most vulnerable part of the electron transfer chain from water to NADP, the loss of activity of which leads to suppression of the photosynthetic activity. Development of modified PS II complexes resistant to high temperature and various chemical agents will be an important step for the development of the artificial photosynthetic systems. Another task of the project, related to the molecular mechanism of electron transfer in PS II, is the study of the light-depended reduction of exogenous electron acceptors. We plan to study the interaction of PS II complexes with different acceptors, including derivatives of quinones and oxidized forms of type c cytochromes. It is planned to find the conditions under which the electron transfer from the primary quinone acceptor QA would occur not only to the natural secondary quinone acceptor QB, but also to the water-soluble exogenous electron acceptors. Direct donation of electrons from the photoreduced primary acceptor QA (bypassing QB) to exogenous electron acceptors is an important step towards the development of an effective and stable converters of solar energy into electrical form, as QB binding site is considerably more labile than the QA binding site. In this case, the possibility emerges of light depended electron transfer from PS II to inorganic semiconductors using water-soluble natural electron acceptors. All of these approaches are important to identify the new properties of PS I and PS II, which is the prerequisite for the design of artificial systems for transformation and storage of solar energy. These systems would include the photolysis of water with the formation of molecular hydrogen and oxygen (PS II), reduction of ferredoxin and NADP (PS I) and transformation of solar energy into electrical form.
В ходе выполнения проекта будет получена новая информация о физико-химических механизмах переноса электрона в пигмент-белковых комплексах ФС 1 и ФС 2 и их взаимодействия с искусственными донорами и акцепторами электрона. Будут найдены ответы на следующие вопросы. (1) Какие из изученных искусственных акцепторов электрона обладают наибольшей способностью принимать электроны от пигмент-белковых комплексов ФС 1 и ФС 2? (2) Какие из кофакторов переноса электрона, входящие в состав ФС 1 и ФС 2, являются наиболее эффективными донорами электронов для изученных медиаторов переноса электрона и каковы константы скоростей соответствующих реакций переноса электрона? (3) Будут выяснены особенности механизмов функционирования ФС 1 и ФС 2 в условиях их взаимодействия с внешними донорами и акцепторами электронов в условиях освещения импульсным и непрерывным светом. Ответы на эти вопросы будут получены в результате следующих комплексных исследований. 1. С помощью импульсной абсорбционной спектрометрии будет исследована кинетика рекомбинации зарядов в нативных и модифицированных комплексах ФС 1 и ФС 2 в присутствии и в отсутствие экзогенных доноров и акцепторов электрона. 2. На основе анализа полученных результатов будут построены кинетические модели прямых и обратных реакций переноса электрона в комплексах ФС 1 и ФС 2, которые позволят оценить константы скоростей отдельных реакций, среднеточечные редокс-потенциалы кофакторов и константы связывания экзогенных акцепторов электрона. 3. С помощью прямого электрометрического метода будут исследованы электрогенные реакции переноса электрона между хинонным акцептором в сайте А1 ФС 1 из мутантного штамма menB цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 и железо-серными кластерами при замещении нативного филлохинона производными нафтохинонов с различными редокс-потенциалами. 4. Взаимодействие различных препаратов ФС 1 с экзогенными акцепторами электрона, включая кислород, в условиях непрерывного освещения будет исследовано с использованием ЭПР спектроскопии и полярографии. 5. Взаимодействие синтетических марганец-содержащих соединений с лишенными комплекса окисления воды (КОВ) препаратами ФС 2 будет изучено с помощью флеш-спектрометрии, импульсной флуорометрии, полярографии и прямой электрометрии. 6. На комплексах ФС 2, лишенных КОВ, с помощью вышеперечисленных методов будет исследован перенос электрона от хинонных акцепторов QA и QB на внешние акцепторы электрона, включающие производные хинонов, окисленный цитохром с и, в конечном счете, на полупроводниковые носители. Исследование кинетики прямых и обратных реакций в комплексах ФС 1 и ФС 2 является предметом изучения во многих лабораториях мира. Особенный интерес вызывает изучение переноса электрона в этих пигмент-белковых комплексах, содержащих различное количество редокс-кофакторов, а также производные хинонов с разными редокс-потенциалами. Систематического изучения взаимодействия таких модифицированных комплексов с экзогенными акцепторами электрона, насколько нам известно, не проводилось. Полученные результаты позволят прояснить механизмы внутрибелкового переноса электрона в ФС 1 и ФС 2, а также механизмы взаимодействия ФС 1 с кислородом с образованием его активных форм. Изучение взаимодействия комплексов ФС 2, лишенных КОВ, с синтетическими марганец-содержащими донорами электрона, а также с экзогенными акцепторами, включая полупроводниковые носители, является важным шагом на пути к созданию высокоэффективных гибридных преобразователей солнечной энергии в электрическую форму, способных к выделению кислорода и водорода.
2017 год - будет изучена кинетика рекомбинации зарядов в комплексах ФС 1, содержащих разное количество Fe-S кластеров и различные хиноны в сайте А1, в присутствии экзогенных акцепторов электрона; будут определены характерные времена восстановления фотоокисленного P700+ от различных акцепторов ФС 1; - методом полярографии будет исследовано поглощение кислорода препаратами ФС 1 (реакция Мелера) в зависимости от природы и концентрации различных доноров и акцепторов электрона в условиях непрерывного освещения; будут исследованы донорные и акцепторные свойства классических медиаторов электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола и N,N,N',N'-тетраметил-p-фенилендиамина; - будет исследовано взаимодействие ФС 1, содержащей различные хиноны в сайте связывания А1, в условиях непрерывного освещения с внешними донорами и акцепторами методом ЭПР-спектроскопии (по кинетике фотоиндуцированного сигнала ЭПР от окисленных центров Р700+); - будет построена кинетическая модель переноса электрона в ФС 1, включающая взаимодействия комплекса с экзогенными донорами и акцепторами, а также реакцию ФС 1 с кислородом; будут получены оценки скоростей прямых и обратных реакций переноса электрона внутри ФС 1, параметры взаимодействия системы с внешними акцепторами, включая кислород; - будет исследовано взаимодействие водорастворимых спиновых меток (стабильные нитроксильные радикалы) с комплексами ФС 1 дикого типа, содержащими разное количество Fe-S кластеров, и мутантного штамма menB с различными хинонами в сайте А1; будет охарактеризовано прямое взаимодействие внутренних кофакторов ФС 1 с гидрофильными экзогенными акцепторами (нитроксильными радикалами) различной химической природы; - с помощью прямого электрометрического метода будут изучены электрогенные реакции, обусловленные переносом зарядов в ядерных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера; ожидается оценить эффективность функционирование отдельных синтетических марганец-содержащих соединений путем регистрации электрогенных реакций, обусловленных переносом электронов и протонов; 2018 год - будет исследован электрогенез в ФС 1 из мутантного штамма menB при переносе электрона с различных хинонов в сайте А1 на железо-серные центры с помощью прямого электрометрического метода; будут определены кинетики и амплитуды электрогенных фаз, обусловленных переносом электрона между хинонами в сайте А1 и [Fe4S4] кластерами; будет оценен относительный вклад симметричных ветвей кофакторов А и В в суммарный электрогенез; - будет определены параметры флуоресценции хлорофилла в препаратах ФС 2, лишенных марганцевого кластера в присутствии различных марагнец-содержащих синтетических комплексов; мы ожидаем оценить эффективность переноса электронов от этих соединений к редокс-активному тирозину YZ, а также фотоокисленному Р680+, а также кинетические параметры реакции окисления первичного хинонного акцептора QA; - будут получены кинетические параметры рекомбинации электрона между хинонными акцепторами и первичным донором электронов Р680+ с помощью измерения светоиндуцированных абсорбционных изменений на длине волны 820 нм в присутствии экзогенных доноров и акцепторов; - будет исследовано взаимодействие водорастворимых парамагнитных зондов с интактными и модифицированными комплексами ФС 2; будет охарактеризовано прямое взаимодействие хинонных акцепторов ФС 2 с гидрофильными нитроксильными радикалами различной химической природы; - проведенные в 2017 годы исследования по взаимодействию водорастворимых спиновых меток с комплексами ФС 1 будут расширены с использованием гидрофобных липидорастворимых спиновых зондов для ФС 1 дикого типа и мутантного штамма menB, содержащего замещенные хиноны в сайте А1, что позволит определить зависимость эффективности внешних акцепторов-парамагнитных зондов от канала их доступа (водная фаза или мембрана) к кофакторами ФС; 2019 год - будут изучены комплексы ФС 2, изолированные из мутантного штамма цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 (c заменой лизина-238 в субъединице D1 на глутаминовую кислоту); будет охарактеризован перенос электронов от первичного хинонного акцептора QA к окисленному цитохрому с; - будет изучено взаимодействие между комплексами ФС 2 и неорганическими полупроводниками (TiO2, оксид индия-олова); будет оценена эффективность окисленного цитохрома с, водорастворимых хинонов, а также редокс-пары ферро-феррицианид в качестве экзогенных интермедиатов этого взаимодействия; - проведенные в 2018 годы исследования по взаимодействию водорастворимых спиновых меток с комплексами ФС 2 будут расширены с использованием гидрофобных липидорастворимых спиновых зондов для ФС 2, что позволит определить зависимость эффективности внешних акцепторов-парамагнитных зондов от канала их доступа (водная фаза или мембрана) к кофакторами ФС; - будет изучено взаимодействие ФС 1 и 2 с ковалентно-связанными нитроксильными метками для изучения зависимости скорости переноса электрона на экзогенный акцептор от его локализации в системе.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | 1 |
Результаты этапа: 1. Изучение кинетики рекомбинации зарядов в комплексах ФС 1, содержащих разное количество Fe-S кластеров и различные хиноны в сайте А1. Были исследованы кинетики восстановления фотоокисленного первичного донора электронов Р700+ в ответ на вспышку возбуждающего света в интактных комплексах фотосистемы 1 (ФС 1) из цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и в комплексах лишенных железо-серных кластеров FA/FB (FX-core), а также в комплексах ФС 1, выделенных из цианобактерий мутантного штамма menB, содержащих пластохинон (menB-PQ) и 2,3-дихлор-1,4-нафтохинон (menB-Cl2NQ), в присутствии различных концентраций экзогенных акцепторов электронов метилвиологена (МВ) и 2,3-дихлор-1,4-нафтохинона (Cl2NQ). Полученные кинетики были аппроксимированы двумя экспоненциальными компонентами, отражающими рекомбинацию зарядов между восстановленными кофакторами ФС 1 и Р700+ и восстановление Р700+ от внешнего донора электронов в той части комплексов, где произошел перенос электрона к внешнему акцептору. Показано, что основная компонента кинетики восстановления Р700+ в FX-core и menB-PQ комплексах ускорена по сравнению с нативным комплексом с ≈50 мс, до ≈1 мс (FX-core) и до ≈3 мс (menB-PQ). Основная фаза кинетики восстановления Р700+ в menB-Cl2NQ имеет характерное время ~150 мкс и соответствует рекомбинации зарядов в ион-радикальной паре Р700+А1-. Показано, что для интактной ФС 1 и для FX-core комплекса Cl2NQ является более эффективным акцептором, чем МВ. Концентрация Cl2NQ, необходимая для достижения 50% вклада медленной компоненты (которая может служить мерой эффективности акцептирования электрона), примерно в два раза ниже по сравнению с МВ. Концентрации полунасыщения реакции переноса электрона на экзогенный акцептор МВ в ряду (интактный комплекс)-(FX-core)-(menB-pQ) соотносятся как 1:200:10. Полученные данные свидетельствуют, что комплексы menB-Cl2NQ восстанавливают МВ, однако максимальная достигнутая скорость взаимодействия menB-Cl2NQ и МВ с ФС 1 была близка к скорости рекомбинации на Р700+. На основе полученных данных был предложен механизм прямого восстановления МВ от Cl2NQ в сайте A1 в комплексах menB-Cl2NQ. Изучение структуры ФС 1 выявило полость размер, находящуюся на расстоянии ~10 Å от филлохинона A1A (в ветви редокс-кофакторов А), сообщающуюся с поверхностью белка и сопоставимую по размерам с молекулой МВ. Мы предполагаем, что низкомолекулярные акцепторы электрона могут взаимодействовать с ФС 1, связываясь с белком в этой полости. 2. Изучение взаимодействия редокс-медиаторов с комплексами ФС 1 методом полярографии в условиях непрерывного освещения. Исследовано поглощение кислорода препаратами ФС 1 (реакция Мелера) в зависимости от природы и концентрации различных доноров и акцепторов электрона в условиях непрерывного освещения, а также изучены донорные и акцепторные свойства классических медиаторов электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола (DCPIP) и N,N,N',N'-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD). Были получены следующие результаты: 1. С целью сравнения эффективности TMPD и DCPIP как доноров электронов в условиях стационарного освещения было оценено влияние концентрации этих медиаторов на стационарный сигнал фотоокисленного P700 в интактных комплексах ФС 1 с помощью PAM-флуориметра, оснащенного модулем для измерения Р700+, в условиях, когда скорость-лимитирующей стадией переноса электрона было восстановление Р700+ редокс-медиаторами. При увеличении концентрации обоих медиаторов наблюдалось падение сигнала Р700+, однако эффект DCPIP был более выраженным, что подтверждает большую эффективность восстановленного DCPIP как донора электронов для Р700+, по сравнению с TMPD. 2. В условиях стационарного освещения, была измерена скорость поглощения кислорода (VO2) ФС 1 в присутствии восстановленных избытком аскорбата (Asc) TMPD или DCPIP. Показано, что в присутствии МВ VO2 была значительно выше в присутствии DCPIP. Это также подтверждает большую эффективность восстановленного DCPIP в качестве донора электрона для ФС 1, чем TMPD. 3. В отсутствие МВ увеличение концентрации TMPD не влияло на VO2, а в его присутствии VO2 линейно увеличивалась. Отсутствие концентрационной зависимости в отсутствие МВ было обусловлено тем, что лимитирующей стадией является перенос электрона от кофакторов ФС 1 к O2, а не восстановление Р700+. 4. В случае DCPIP в отсутствие МВ VO2 линейно увеличивалась во всем исследуемом диапазоне концентраций. В этом случае перенос электрона от кофакторов ФС 1 к O2 не является скорость-лимитирующей стадией суммарной реакции. Добавление МВ приводило к существенному увеличению VO2, однако не влияло на характер зависимости. Было предположено, что в присутствии DCPIP происходит окисление терминальных кофакторов ФС 1 экзогенным акцептором электронов, который способен подобно МВ восстанавливать кислород. Таким акцептором, вероятно, является окисленная форма DCPIP (DCPIPох), которая присутствует в среде несмотря на избыток Asc. 5. Известно, что МВ принимает электроны от терминального железо-серного кластера FB, поэтому можно предположить сходный механизм восстановления DCPIPох. На препаратах FX-core, лишенных терминальных кластеров FA/FB, в присутствии МВ VO2 была ниже, чем в случае интактного комплекса и для TMPD, и для DCPIP. В то же время, в отсутствие МВ значения VO2 были близки к значениям, наблюдаемым для интактных комплексов, и не зависели от концентрации TMPD, тогда как в случае DCPIP наблюдалось значительное снижение VO2 при всех концентрациях медиатора. Эти данные указывают на сходство механизмов взаимодействия DCPIPох и МВ с ФС 1. 6. рН-зависимости VO2 в присутствии МВ для обоих медиаторов имели колоколообразную форму с максимумом при рН 8,5. При наличии в среде МВ рН-зависимости VO2 в присутствии DCPIP и TMPD имели различную форму. В случае TMPD VO2 практически не зависела от рН. Этот результат подтверждает, что восстановление O2, а не восстановление Р700+, является скорость-лимитирующей стадией переноса электрона. В случае DCPIP рН-зависимость VO2 имела форму гауссианы с максимумом при рН 7,8 даже в отсутствие МВ. Это можно объяснить наличием молекул DCPIPох, которые принимают электроны от ФС 1, снимая ограничение на акцепторной стороне. В этих условиях VO2 отражает рН-зависимое восстановление Р700+. 3. Исследование взаимодействия комплексов ФС 1 с внешними донорами и акцепторами электронов методом ЭПР-спектроскопии в условиях непрерывного освещения. Для оценки эффективности взаимодействия изолированных комплексов ФС 1 с экзогенными акцепторами электрона с помощью метода ЭПР были зарегистрированы светозависимые изменения редокс-состояния Р700 в присутствии метилвиологена (МВ), высокопотенциального производного нафтохинона Cl2NQ и аскорбата. 1. В присутствии AscH- происходило небольшое уменьшение светоиндуцированного сигнала ЭПР, принадлежащего катион-радикалам Р700+. Добавление искусственного акцептора МВ индуцировало увеличение сигнала. 2. Добавление Cl2NQ в присутствии AscH- вызывало уменьшение сигнала Р700+ и увеличение дублетного сигнала ЭПР, принадлежащего анион-радикалу Asc•-. Этот эффект можно объяснить тем, что Cl2NQ служит медиатором переноса электрона между терминальными кофакторами ФС 1 и окисленной формой аскорбата (Asc). 3. Результаты регистрации кинетики фотоокисления и темнового восстановления Р700+ показывают, что в присутствии Cl2NQ происходило ускорение фотоокисления Р700 по сравнению с контролем (без добавок). Однако скорость последующего темнового восстановления Р700+ в отсутствие аскорбата оставалась неизменной. 4. В присутствии AscH- добавление Cl2NQ значительно ускоряло темновое восстановление Р700+. Этот результат указывает на синергетическое действие Cl2NQ и аскорбата. 5. Возможной причиной отсутствия заметного ускорения темнового восстановления Р700+ может быть реокисление полувосстановленного Cl2NQ (семихинон Cl2NQ•-) молекулярным кислородом. Действительно, в анаэробных условиях мы наблюдали ускорение восстановления Р700+ в темноте по сравнению с аэрированными образцами. Таким образом, показано, что в условиях стационарного освещения не только МВ, но и Cl2NQ является эффективным экзогенным акцептором электрона от ФС 1. Способность восстановленного Cl2NQ донировать электрон на фотоокисленный Р700+ опосредована его взаимодействием с аскорбатом. 4. Кинетическая модель взаимодействия ФС 1 с водорастворимыми экзогенными донорами и акцепторами. Разработана кинетическая модель реакций переноса электрона в ФС 1, которая включала: прямые и обратные реакции переноса электрона между редокс-кофакторами А0↔А1↔Fx↔FA/FB с варьируемой активностью симметричных ветвей кофакторов А и В; рекомбинацию электрона с хинонов A1A и A1B на P700+; взаимодействие терминальных акцепторов ФС 1 с экзогенными акцепторами (растворенный молекулярный кислород и экзогенные акцепторы); донирование электрона на P700+ экзогенным донором DCPIP. Параметры модели были определены на основании глобального анализа совокупности данных, описанных в п.1. Анализ кинетических зависимостей с помощью разработанной модели позволил сделать следующие выводы: 1. Рекомбинация зарядов между терминальными железо-серными кластерами [FA/FB]- и Р700+ (в нативных комплексах) и между FX- и Р700+ (в комплексах FX-core) происходит через промежуточные стадии с участием восстановленного хинона в сайте А1. 2. На основании кинетического анализа были определены термодинамические параметры кофакторов ФС 1, а именно, константы равновесия отдельных реакций и редокс-потенциалы кофакторов в нативных и в структурно модифицированных комплексах. В интактной ФС 1 значение свободной энергии ΔG электронного перехода между FX и [FA/FB] составило -130 мэВ, между вторичным хинонным акцептором A1 в ветви А и FX - -50 мэВ. Величина ΔG между A1A и FX для PQ в ФС 1 из штамма menB, содержащего в сайте А1 PQ, составляет +45 мэВ, что создает энергетический барьер для переноса электрона на терминальные акцепторы FA/FB. Окислительно-восстановительный потенциал Cl2NQ в сайте A1A выше -400 мВ, что полностью предотвращает перенос электрона на терминальные акцепторы в модифицированном комплексе menB-Cl2NQ. 3. Результаты, полученные для комплекса ФС 1, содержащего Cl2NQ в сайте A1, показывают, что экзогенный акцептор МВ способен принимать электроны непосредственно от A1, минуя железо-серные кластеры. Однако из-за низкого значения константы Михаэлиса эта реакция не может эффективно конкурировать с рекомбинацией заряда от A1- к P700 + даже при высокой концентрации Cl2NQ. 4. Скорость взаимодействия экзогенных акцепторов МВ и кислорода с Cl2NQ в сайте A1 была крайне высокой, приближаясь к пределу диффузионно-контролируемых реакций. Побочная генерация супероксид-радикала в сайте А1 путем восстановления кислорода (реакция Мелера) может составлять ≥0,3% от общего потока электронов в ФС 1. Высокоэффективный перенос электрона на железо-серные кластеры в ФС 1 может служить эволюционной защитой против таких побочных реакций. 5. Оценены бимолекулярные константы скорости и константы диссоциации различных препаратов ФС 1 с экзогенными акцепторами МВ и Cl2NQ. Значения констант скорости переноса электрона от ФС 1 к МВ для интактного комплекса и ФС 1 из штамма menB были близки, их величина в 3 раза превышала соответствующую константу скорости для комплексов FX-core. Значения констант диссоциации для интактной ФС 1 и FX-core с Cl2NQ в качестве экзогенного акцептора были в 8 раз выше соответствующих констант диссоциации с МВ. 5. Взаимодействие водорастворимых спиновых меток (стабильные нитроксильные радикалы) с комплексами ФС 1 дикого типа, содержащими разное количество Fe-S кластеров, и мутантного штамма menB с различными хинонами в сайте А1. Для исследования эффективности взаимодействия различных препаратов ФС 1 с внешними акцепторами электрона нами были использованы водорастворимые нитроксильные радикалы (спиновые метки) двух типов: электронейтральная 4-амино-2,2,5,5-тетраметил-2,5-дигидро-1H-имидазол-1-оксил (ATI) и положительно заряженная 4-амино-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил (ТА). Поскольку, аскорбат способен восстанавливать парамагнитный фрагмент спиновых меток, а ферроцианид практически не влияет на интенсивность сигнала спиновых меток в растворе, в этой серии экспериментов ферроцианид был использован в качестве экзогенного донора электронов для Р700+. В ходе исследования акцепторных свойств водорастворимых спиновых меток нами были получены следующие результаты: 1. Измерения кинетики фотоиндуцированных изменений амплитуды сигналов ЭПР спиновых меток показали, что на свету в аэробной суспензии обе спиновые метки, АТI и ТА, практически не восстанавливаются. Это обусловлено тем, что в аэробных условиях скорость окисления акцепторов ФС 1 кислородом была гораздо выше, чем скорость переноса электрона к спиновым меткам. 2. В анаэробных условиях наблюдалась необратимая потеря парамагнетизма молекулами электронейтральных спиновых меток, обусловленная восстановлением их нитроксильных фрагментов. 3. Скорости восстановления радикалов зависели от типа радикала. Для положительно заряженной метки ТА мы не наблюдали восстановления метки ни в аэрированной, ни в деаэрированной среде. Для электронейтральной спиновой метки ATI было обнаружено фотоиндуцированное восстановление метки в анаэробных условиях. 4. Было обнаружено, что в случае интактных комплексов ФС 1 скорость восстановления метки была почти в два раза выше по сравнению с FX-core комплексов. Это может быть обусловлено более высокой доступностью железо-серных кластеров FA и FB по сравнению с кластером FX в FX-core, поскольку расстояние от FB до поверхности белка в интактных комплексах меньше, чем аналогичное расстояние от FX в FX-core комплексах, лишенных субъединицы PsaC и терминальных кластеров FAFB. 6. Исследование электрогенных реакций на донорном участке нативных и лишенных марганцевого кластера ядерных комплексах фотосистемы 2. 1) С помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих кислород-выделяющие ядерные комплексы из фотосистемы 2 (ФС 2) был изучен механизм генерации мембранного потенциала, обусловленной переходами между S-состояниями комплекса окисления воды (КОВ) в отсутствие и в присутствии дисахарида трегалозы. Продемонстрировано, что в адаптированных к темноте образцах в ответ на последовательные лазерные вспышки наблюдается быстрый рост мембранного потенциала, сопровождающийся дополнительным нарастанием в ответ на первые три вспышки. Наблюдаемые дополнительные электрогенные стадии переноса зарядов обусловлены S1 → S2, S2 → S3, и S4 → S0 переходами КОВ в отсутствие и в присутствии 1 М трегалозы и характеризуются одинаковой амплитудой. Показано, что в отличие от S1 → S2 перехода, обусловленного переносом электрона от иона марганца к редокс-активному радикалу тирозина YZ•, реакции выброса протонов из марганцевого кластера в водную фазу, обусловленные S2 → S3 и S4 → S0 переходами в КОВ ускоряются приблизительно в два раза. 2) С помощью прямого электрометрического метода был исследован механизм генерации трансмембранной разности электрических потенциалов на протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 2, не содержащие ионов марганца в присутствии синтетического 4-х ядерного марганцевого кластера с триподными тетрадентатными лигандами. Продемонстрировано, что в ответ на вспышку лазера в отсутствие экзогенных добавок происходит быстрое нарастание электрического потенциала за время более короткое, чем временное разрешение измерительной установки. Наблюдаемое быстрое образование фотопотенциала обусловлено переносом электрона от редокс-активного тирозина YZ к первичному хинонному акцептору электронов QA, а происходящий далее спад обусловлен рекомбинацией зарядов между первичным хинонным акцептором QA- и окисленным YZ. Добавление синтетического 4-х ядерного марганцевого кластера приводит к замедлению кинетики спада фотоэлектрического ответа и появлению дополнительной миллисекундной фазы нарастания фотопотенциала с амплитудой около 25% от общей амплитуды. Полученные результаты впервые демонстрируют быстрый и эффективный перенос электрона от синтетического марганцевого кластера, внутри белкового матрикса реакционного центра ФС 2 к окисленному радикалу тирозина YZ. Эти результаты важны для понимания молекулярного механизма образования разности электрических потенциалов на донорном участке ФС 2. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | 2 |
Результаты этапа: Пигмент-белковые комплексы фотосистемы 1 (ФС1) и фотосистемы 2 (ФС2) являются универсальными биологическими преобразователями солнечной энергии. В природе эти комплексы являются функциональной частью фотосинтетической электрон-транспортной цепи, важнейшим компонентом которой являются подвижные переносчики электронов между комплексами. Эти переносчики осуществляют окисление терминальных кофакторов электронного транспорта в комплексах ФС1 и ФС2 и восстановление фотоокисленных первичных доноров электронов. Важной и актуальной проблемой как в области изучения молекулярных механизмов переноса электрона в этих комплексах, так и в области их возможного применения в качестве искусственных высокоэффективных преобразователей солнечной энергии, является изучение их взаимодействия с донорами и акцепторами электронов. В ходе выполнения работ по проекту в 2018 году нами были продолжены исследования взаимодействия выделенных пигмент-белковых комплексов ФС1 и ФС2 с экзогенными донорами и акцепторами электронов в различных условиях. Исследования проводились как с помощью биофизических методов, так и методами молекулярной динамики, которые позволили промоделировать некоторые из механизмов взаимодействия ФС1 с экзогенными акцепторами электронов. Особое внимание было уделено экспериментальному изучению взаимодействия лишенных марганцевого кластера комплексов ФС2 (апо-КОВ-ФС2) с искусственными донорами электронов. Исследования выполнены путем регистрации кинетики фотоиндуцированных изменений флуоресценции, прямого электрометрического метода и импульсной абсорбционной спектроскопии. Влияние синтетических Mn-содержащих комплексов [Mn(III)Mn(III)(HNQOX)4(OAc)2] (М-2) и [Mn(III)-O-Mn(III)(HNQOX)2(OAc)2(H2O)2] (М-3) на процессы восстановления редокс-активного тирозина YZ и фотоокисление первичного хинонного кофактора QA было сопоставлено с действием MnCl2. В ходе исследований была продемонстрирована большая донорная эффективность комплекса М-3 по сравнению с М-2 и MnCl2. В кинетике нарастания мембранного потенциала, индуцированного лазерными вспышками, помимо быстрого разделения зарядов, были дополнительно обнаружены более медленные электрогенные фазы, обусловленные переносом электронов от синтетических Mn-содержащих комплексов на YZ. Показано, что добавление этих соединений не влияет на процессы, протекающие на акцепторной стороне ФС2. Интересным результатом является обнаружение эффекта ацетата натрия, вызывающего ускорение переноса электрона от YZ к фотоокисленному первичному донору электронов ФС2 Р680+ в препаратах апо-КОВ-ФС2. Предполагается, что добавленный ацетат натрия является акцептором протона, донируемого YZ, что облегчает перенос электрона на Р680+. Взаимодействие ядерных комплексов ФС2 с экзогенными акцепторами электронов было исследовано с помощью прямого электрометрического метода. Это позволило выявить наличие дополнительных электрогенных реакций, сопровождающих восстановление 2,6-дихлоро-п-бензохинона (DCBQ) и окисленной формы цитохрома с. Взаимодействие комплексов ФС2 с экзогенными акцепторами электронов изучалось также в условиях стационарного освещения с помощью метода ЭПР. Было выявлено восстановление отрицательно заряженных и полярных водорастворимых спиновых меток Tacet и NTI на акцепторной стороне ФС2 и предложен механизм такого взаимодействия. Взаимодействие комплексов ФС1 из Synechocystis sp. PCC 6803 с различными редокс-медиаторами было охарактеризовано в условиях импульсного освещения. Методом импульсной абсорбционной спектроскопии на длине волны 820 нм было обнаружено акцепторное действие окисленной формы аскорбата натрия, образующейся при окислении аскорбата ФС1. Детально изучено влияние соотношения окисленных и восстановленных форм 2,6-дихлорфенолиндофенола (DCPIP) и N,N,N’,N’-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD) на кинетику переноса электрона в ФС1. Это соотношение, по-видимому, оказывает существенное влияние на процессы окисления и восстановления первичного донора электронов Р700 ФС1 на стационарном свету. Нами было изучено влияние DCPIP на эти процессы и стационарную концентрацию Р700+ при освещении с помощью метода ЭПР. Показано, что акцепторная эффективность DCPIP выше, чем донорная. Кроме того, с помощью полярографии было выявлено взаимодействие DCPIP с молекулярным кислородом. Таким образом, DCPIP является соединением, опосредующим как перенос электрона от восстановленного аскорбата натрия к Р700+, так и перенос электрона от терминальных кофакторов ФС1 к молекулярному кислороду. В условиях стационарного освещения нами была изучена имеющая важное физиологическое значение реакция ФС1 с молекулярным кислородом. При этом были сопоставлены измеренные полярографически зависимости скорости восстановления кислорода комплексами ФС1 из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, содержащие нативный филлохинон или встроенный пластохинон (мутантный штамм menD). Было показано, что комплексы ФС1, содержащие пластохинон, восстанавливают молекулярный кислород более эффективно, чем нативные комплексы ФС1 из дикого типа. Исследованы индуцированные лазерными вспышками электрогенные реакции переноса электрона в комплексах ФС1 из мутантного штамма menB цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, содержащих пластохинон и встроенных в липосомы в присутствии акцептора электронов метилвиологена. Оценен вклад электрогенной компоненты переноса электрона от хинонных кофакторов ФС1 на железо-серные кластеры в общий электрогенез в ФС1. В ходе выполнения работ по проекту в 2017 году нами были получены данные о прямом взаимодействии хинонного кофактора ФС1 с экзогенным акцептором электронов метилвиологеном. С целью дальнейшего изучения механизма этой реакции была начата работа по характеризации взаимодействия содержащих замещенные хинонные кофакторы комплексов ФС1 и акцептора электронов бензилвиологена. Взаимодействие содержащих замещенные хиноны комплексов ФС1 с метилвиологеном было изучено в условиях стационарного освещения методом ЭПР. Было показано, что в содержащих комплексах ФС1, содержащих в сайте А1 высокопотенциальное производное нафтохинона 2,3-дихлор-1,4-нафтохинон (Cl2NQ), восстановление метилвиологена хинонным кофактором приводит к увеличению стационарной концентрации фотоокисленного первичного донора электронов ФС1 (Р700+). Важным шагом на пути изучения функционирования ФС1 in situ является изучение структурных перестроек в липидной фазе мембраны, окружающей пигмент-белковый комплекс. Изучение этих процессов возможно с использованием гидрофобных спиновых зондов (СЗ) на основе стеариновой кислоты (СЗ типа n-SASL). Однако важно исключить восстановление этих зондов от кофакторов ФС1. Путем анализа ЭПР-сигнала СЗ в присутствии встроенных в липосомы комплексов ФС1 нами было показано отсутствие взаимодействия ФС1 и зондов. В ходе работы по проекту в 2018 году нами было исследовано влияние температуры на кинетику переноса зарядов в интактных комплексах ФС1 и в FX-core комплексах, не содержащих терминальные Fe4S4 кластеры FA/FB. Анализ кинетики рекомбинации зарядов при разных температурах позволил приписать кинетические компоненты реакциям, соответствующим обратному переносу электронов от различных акцепторов на фотоокисленный Р700. Определены кинетические и термодинамические параметры при разных температурах. Показано, что кинетика рекомбинации зарядов с Fe4S4 кластеров является неэкспоненциальной при температурах ниже 200 К как для интактных, так и для FX-core комплексов. Продемонстрированы два пути рекомбинации с терминальных кластеров FA/FB – прямой через кластер FX (при температуре выше 270 К) и опосредованный через FX и хинонный акцептор A1A (в диапазоне 200 – 260 К) с энергиями активации Ea 270 мэВ и 30 мэВ, соответственно. Кинетика обратного переноса электрона при температурах ниже точки стеклования смеси вода-глицерин (170 К) была безактивационной. Сравнение кинетик переноса электронов в ФС1 при температурах ниже 200 К и при иммобилизации в высушенной трегалозной матрице при комнатной температуре показало как сходство, так и некоторые различия эффектов ограничения конформационной подвижности белка в этих условиях. Показано, что при понижении как температуры, так и влажности происходит последовательный рост вклада рекомбинации с кластера FX и хинона А1 за счет уменьшения рекомбинации с кластеров FA/FB на фотоокисленный Р700. С использованием полученных ранее данных была построена молекулярно-динамическая модель цианобактериальной ФС1, погруженной в бислойную липидную мембрану. С помощью этой модели была изучена возможность прямого восстановления акцептора электронов Cl2NQ с хинонным кофактором в сайте связывания А1 ФС1. Показано, что Cl2NQ способен образовывать водородные связи с аминокислотой GLY50 субъединицы Е ФС 1, что обеспечивает его фиксацию во внутрибелковой водной полости вблизи сайта А1А. Таким образом, подтверждена возможность докинга Cl2NQ на расстоянии ~9 Å от сайта связывания хинона А1А, что обеспечивает возможность эффективного переноса электрона от А1А непосредственно на экзогенный акцептор при затрудненном переносе электрона на железо-серные кластеры. Моделирование также показало, что помещенный в ту же водную полость молекулярный кислород стабильно удерживается на расстоянии ~8,4 Å от хинона А1А и поэтому может служить эффективным акцептором электрона от хинонного кофактора. Важным результатом с точки зрения описания процессов переноса электрона в комплексах ФС1 является расчет возможных путей рекомбинации электрона с хинонов А1А/А1В. Для обнаруженных асимметричных путей количественно оценены факторы электронного сопряжения между P700 и А1А/A1B, которые составили 0.13 и 2.3 мкэВ. Полученные оценки факторов сопряжения согласуются с экспериментально наблюдаемой разницей скоростей рекомбинации электрона с хинонов А1А и А1В на фотоокисленный димер молекул хлорофилла Р700. | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | 3 |
Результаты этапа: C помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы фотосистемы 2 (ФС 2) из шпината был изучен прямой перенос электрона от восстановленного первичного хинонного акцептора QA к окисленному цитохрому с (цит с3+) при однократном срабатывании реакционного центра (РЦ). В присутствии цит с3+ (20 мкМ) в ответ на единичные вспышки лазера регистрируется кинетика генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (∆ψ). В этой кинетике, помимо быстрой неразрешимой электрогенной фазы, обусловленной переносом электрона от редокс-активного тирозина YZ к первичному хинонному акцептору QA (< 0.2 мкс), появляется дополнительная фаза нарастания с характерным временем около 40 мкс и амплитудой около 10% при рН=7.5. Выявление эффективного векторного прямого переноса электрона от QA на цит с3+ в комплексах ФС 2 из растений, представляется важным для использования такой системы при разработке гибридных преобразователей солнечной энергии в электрическую форму. Целью дальнейшей работы являлась иммобилизация кислород-выделяющих ядерных комплексов ФС 2 в присутствии дисахарида трегалозы на полупроводниковом электроде из оксидов индия и олова (ITO) и дальнейшая регистрация ∆ψ при стационарном освещении с помощью электрометрического метода. В качестве мезопористых структур были использованы нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,22 мкм. Включение белого света приводило к генерации ∆ψ и выходу разности потенциалов на стационарный уровень величиной около 40 мВ. Такая гибридная система позволяет регистрировать образование ∆ψ без видимой потери активности в течение, по меньшей мере, 4 ч при инкубации при комнатной температуре в темноте. ITO-электроды с кислород-выделяющими ядерными комплексами ФС 2 способны регистрировать светозависимое образование разности электрических потенциалов вследствие разделения зарядов в РЦ ФС 2, последующего восстановления первичного донора электрона Р680 за счет окисления воды и инжектирования электрона от первичного хинонного акцептора QA в зону проводимости полупроводника ITO с участием редокс-медиатора 2,6-диметил-1,4-бензхохинона. В продолжение исследований, выполненных ранее, на 2019 год было запланировано провести исследование фотоиндуцированных редокс-превращений спиновых меток различной природы с изолированными белковыми комплексами ФС 1 и ФС 2. Спиновыми зондами обычно называют производные стабильных нитроксильных радикалов, растворяемых в липидной фазе мембраны; к спиновым меткам относят производные нитроксильных радикалов, ковалентно связываемых с белками, которые служат индикаторами структурных перестроек белков. Было изучено взаимодействие липидорастворимых спиновых зондов – спин-меченых производных стеариновой кислоты (5-доксилстеарат, 5-SASL, или 16-доксилстеарат, 16-SASL) – с протеолипосомами, содержащими ФС 1 или ядерные комплексы ФС 2. Характерная форма спектров ЭПР спиновых зондов в суспензии протеолипосом свидетельствовала о том, что молекулы зондов растворялись в гидрофобной фазе мембраны. Подчеркнем, что при этом не наблюдалось фотоиндуцированного восстановления молекул зондов от ФС 1 или ФС 2. Можно сделать вывод, что нитроксильные фрагменты зондов, локализованные внутри липидного бислоя протеолипосом, удалены от акцепторных участков электрон-транспортных цепей ФС 1 и ФС 2 на достаточно большое расстояние (~50-65 Å), препятствующее переносу электрона от редокс-кофакторов ФС 1 и ФС 2 к нитроксильным радикалам гидрофобных спиновых зондов. В качестве спиновых меток, связываемых ковалентно с ФС 1 или ФС 2, были использованы: а) иод-ацетамидная спиновая метка и б) малеимидная спиновая метка. Интенсивность сигнала ЭПР ковалентно-связанной иод-ацетамидной метки была заметно ниже интенсивности сигнала связанной малеимидной метки. По этой причине основное внимание было уделено изучению спектров ЭПР малеимидной метки. Нами было зарегистрировано появление фотоиндуцированного сигнала ковалентно-связанной малеимидной метки только в случае ФС 2, что свидетельствует о ее восстановлении от редокс-кофакторов ФС 2, наиболее вероятно от пластосемихинона QA. Отсутствие фотоиндуцированного сигнала метки в случае ФС 1, вероятно, обусловлено удаленностью сайта связывания метки от терминальных редокс-кофакторов электрон-транспортной цепи ФС 1 (30-50 Å). В качестве экзогенного донора для изолированных комплексов ФС 1 традиционно используется редокс-пара, состоящая из аскорбата (Аск) и медиатора, чаще всего 2,6-дихлорфенолиндофенола (DCPIP) или N,N,N’,N’-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD), который служит переносчиком электрона от Аск на окисленный первичный донор электронов в ФС 1, Р700+. В 2019 году на основе анализа зависимости кинетики восстановления Р700+ от концентрации редокс-медиаторов было продемонстрировано, что в условиях импульсного освещения DCPIP, TMPD и Аск также являются эффективными акцепторами электронов. DCPIP демонстрирует самую высокую акцепторную эффективность, которая существенно зависит от присутствия кислорода в среде. Окисленная форма Аск является наименее эффективным акцептором, скорость ее восстановления железо-серными кластерами низка как в интактных комплексах, так и в комплексах FX-core, лишенных терминальных 4Fe-4S кластеров FA/FB. Это проявляется в том, что скорость восстановления окисленного Аск низка по сравнению со скоростью обратного переноса электрона в комплексах FX-core. Сопоставление взаимодействия комплексов ФС 1 с Аск в условиях импульсного и стационарного освещения позволило выявить различие в механизмах переноса электрона в ФС 1 в зависимости от типа освещения. Получены указания на то, что в условиях стационарного освещения наблюдается перевосстановление кофакторов электрон-транспортной цепи ФС 1, которое препятствует рекомбинации и увеличивает время жизни терминальных редокс-кофакторов на акцепторном участке в заряженном состоянии. Эти предположения согласуется с нашими предыдущими данными об участии филлохинона в сайте А1 в восстановлении кислорода от ФС 1 при высокой интенсивности освещения. В настоящей работе нами была более детально исследована роль филлохинона в этом процессе. Для этого была изучена зависимость кажущейся константы скорости реакции восстановления кислорода в ФС 1 (k2) от интенсивности света. Величину k2 оценивали по скорости поглощения кислорода в суспензии ФС 1 в условиях пониженной концентрации кислорода (10-30 мкМ). Такие зависимости регистрировали в суспензии интактных комплексов ФС 1 в присутствии и в отсутствие медиатора эффективного переноса электрона от FA/FB к молекулам O2 - метилвиологена. Кроме того, были сопоставлены зависимости величины k2 от интенсивности света для комплексов ФС 1 с различным числом 4Fe-4S кластеров (интактных, FX-core и лишенных всех трех 4Fe-4S кластеров A1-core комплексах). Полученные данные указывают на существование различных редокс-кофакторов, участвующих в восстановлении кислорода в ФС 1. Наибольший вклад в восстановление кислорода при высоких интенсивностях света во всех типах исследованных нами комплексов вносит филлосемихинон в сайте А1. Взаимодействие ФС 1 с молекулярным кислородом представляет особый интерес с точки зрения оценки скорости фотогенерации активных форм кислорода в процессе фотосинтеза. Методом потенциала средней силы (PMF) был рассчитан энергетический профиль для движения молекулы кислорода вдоль водного канала вблизи сайта вторичного акцептора электронов филлохинона А1 в ФС 1. Были получены оценки изменения энтальпии, трансляционной и вращательной энтропии при связывании кислорода в этом кармане. Показан существенный вклад гидрофобных взаимодействий в свободную энергию связывания.Оценка общей энергии связывания молекулярного кислорода составила –(10-19) кДж/моль. С помощью программы AutoDock Vina проведен докинг 2,3-дихлор-нафтохинона на поверхности ФС 1 и получены оценки энергии связывания для обнаруженных потенциальных сайтов связывания. С помощью данной программы были найдены альтернативные сайт связывания кислорода и 2,3-дихлор-нафтохинона вблизи железо-серных кластеров в акцепторной части ФС 1. Были рассчитаны молекулярные потенциалы метилвиологена в силовом поле Amber. В случае продолжения проекта они будут использованы для молекулярно-динамического моделирования взаимодействия фотосистемы 1 с метилвиологеном. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".