Механизмы переноса электронов в интактных и модифицированных комплексах фотосистем 1 и 2 и их взаимодействия с экзогенными донорами и акцепторамиНИР

Mechanisms of Electron Transfer in the Intact and Modified Photosystem I and II Complexes and their Interaction with Exogenous Donors and Acceptors

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. 1
Результаты этапа: 1. Изучение кинетики рекомбинации зарядов в комплексах ФС 1, содержащих разное количество Fe-S кластеров и различные хиноны в сайте А1. Были исследованы кинетики восстановления фотоокисленного первичного донора электронов Р700+ в ответ на вспышку возбуждающего света в интактных комплексах фотосистемы 1 (ФС 1) из цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и в комплексах лишенных железо-серных кластеров FA/FB (FX-core), а также в комплексах ФС 1, выделенных из цианобактерий мутантного штамма menB, содержащих пластохинон (menB-PQ) и 2,3-дихлор-1,4-нафтохинон (menB-Cl2NQ), в присутствии различных концентраций экзогенных акцепторов электронов метилвиологена (МВ) и 2,3-дихлор-1,4-нафтохинона (Cl2NQ). Полученные кинетики были аппроксимированы двумя экспоненциальными компонентами, отражающими рекомбинацию зарядов между восстановленными кофакторами ФС 1 и Р700+ и восстановление Р700+ от внешнего донора электронов в той части комплексов, где произошел перенос электрона к внешнему акцептору. Показано, что основная компонента кинетики восстановления Р700+ в FX-core и menB-PQ комплексах ускорена по сравнению с нативным комплексом с ≈50 мс, до ≈1 мс (FX-core) и до ≈3 мс (menB-PQ). Основная фаза кинетики восстановления Р700+ в menB-Cl2NQ имеет характерное время ~150 мкс и соответствует рекомбинации зарядов в ион-радикальной паре Р700+А1-. Показано, что для интактной ФС 1 и для FX-core комплекса Cl2NQ является более эффективным акцептором, чем МВ. Концентрация Cl2NQ, необходимая для достижения 50% вклада медленной компоненты (которая может служить мерой эффективности акцептирования электрона), примерно в два раза ниже по сравнению с МВ. Концентрации полунасыщения реакции переноса электрона на экзогенный акцептор МВ в ряду (интактный комплекс)-(FX-core)-(menB-pQ) соотносятся как 1:200:10. Полученные данные свидетельствуют, что комплексы menB-Cl2NQ восстанавливают МВ, однако максимальная достигнутая скорость взаимодействия menB-Cl2NQ и МВ с ФС 1 была близка к скорости рекомбинации на Р700+. На основе полученных данных был предложен механизм прямого восстановления МВ от Cl2NQ в сайте A1 в комплексах menB-Cl2NQ. Изучение структуры ФС 1 выявило полость размер, находящуюся на расстоянии ~10 Å от филлохинона A1A (в ветви редокс-кофакторов А), сообщающуюся с поверхностью белка и сопоставимую по размерам с молекулой МВ. Мы предполагаем, что низкомолекулярные акцепторы электрона могут взаимодействовать с ФС 1, связываясь с белком в этой полости. 2. Изучение взаимодействия редокс-медиаторов с комплексами ФС 1 методом полярографии в условиях непрерывного освещения. Исследовано поглощение кислорода препаратами ФС 1 (реакция Мелера) в зависимости от природы и концентрации различных доноров и акцепторов электрона в условиях непрерывного освещения, а также изучены донорные и акцепторные свойства классических медиаторов электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола (DCPIP) и N,N,N',N'-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD). Были получены следующие результаты: 1. С целью сравнения эффективности TMPD и DCPIP как доноров электронов в условиях стационарного освещения было оценено влияние концентрации этих медиаторов на стационарный сигнал фотоокисленного P700 в интактных комплексах ФС 1 с помощью PAM-флуориметра, оснащенного модулем для измерения Р700+, в условиях, когда скорость-лимитирующей стадией переноса электрона было восстановление Р700+ редокс-медиаторами. При увеличении концентрации обоих медиаторов наблюдалось падение сигнала Р700+, однако эффект DCPIP был более выраженным, что подтверждает большую эффективность восстановленного DCPIP как донора электронов для Р700+, по сравнению с TMPD. 2. В условиях стационарного освещения, была измерена скорость поглощения кислорода (VO2) ФС 1 в присутствии восстановленных избытком аскорбата (Asc) TMPD или DCPIP. Показано, что в присутствии МВ VO2 была значительно выше в присутствии DCPIP. Это также подтверждает большую эффективность восстановленного DCPIP в качестве донора электрона для ФС 1, чем TMPD. 3. В отсутствие МВ увеличение концентрации TMPD не влияло на VO2, а в его присутствии VO2 линейно увеличивалась. Отсутствие концентрационной зависимости в отсутствие МВ было обусловлено тем, что лимитирующей стадией является перенос электрона от кофакторов ФС 1 к O2, а не восстановление Р700+. 4. В случае DCPIP в отсутствие МВ VO2 линейно увеличивалась во всем исследуемом диапазоне концентраций. В этом случае перенос электрона от кофакторов ФС 1 к O2 не является скорость-лимитирующей стадией суммарной реакции. Добавление МВ приводило к существенному увеличению VO2, однако не влияло на характер зависимости. Было предположено, что в присутствии DCPIP происходит окисление терминальных кофакторов ФС 1 экзогенным акцептором электронов, который способен подобно МВ восстанавливать кислород. Таким акцептором, вероятно, является окисленная форма DCPIP (DCPIPох), которая присутствует в среде несмотря на избыток Asc. 5. Известно, что МВ принимает электроны от терминального железо-серного кластера FB, поэтому можно предположить сходный механизм восстановления DCPIPох. На препаратах FX-core, лишенных терминальных кластеров FA/FB, в присутствии МВ VO2 была ниже, чем в случае интактного комплекса и для TMPD, и для DCPIP. В то же время, в отсутствие МВ значения VO2 были близки к значениям, наблюдаемым для интактных комплексов, и не зависели от концентрации TMPD, тогда как в случае DCPIP наблюдалось значительное снижение VO2 при всех концентрациях медиатора. Эти данные указывают на сходство механизмов взаимодействия DCPIPох и МВ с ФС 1. 6. рН-зависимости VO2 в присутствии МВ для обоих медиаторов имели колоколообразную форму с максимумом при рН 8,5. При наличии в среде МВ рН-зависимости VO2 в присутствии DCPIP и TMPD имели различную форму. В случае TMPD VO2 практически не зависела от рН. Этот результат подтверждает, что восстановление O2, а не восстановление Р700+, является скорость-лимитирующей стадией переноса электрона. В случае DCPIP рН-зависимость VO2 имела форму гауссианы с максимумом при рН 7,8 даже в отсутствие МВ. Это можно объяснить наличием молекул DCPIPох, которые принимают электроны от ФС 1, снимая ограничение на акцепторной стороне. В этих условиях VO2 отражает рН-зависимое восстановление Р700+. 3. Исследование взаимодействия комплексов ФС 1 с внешними донорами и акцепторами электронов методом ЭПР-спектроскопии в условиях непрерывного освещения. Для оценки эффективности взаимодействия изолированных комплексов ФС 1 с экзогенными акцепторами электрона с помощью метода ЭПР были зарегистрированы светозависимые изменения редокс-состояния Р700 в присутствии метилвиологена (МВ), высокопотенциального производного нафтохинона Cl2NQ и аскорбата. 1. В присутствии AscH- происходило небольшое уменьшение светоиндуцированного сигнала ЭПР, принадлежащего катион-радикалам Р700+. Добавление искусственного акцептора МВ индуцировало увеличение сигнала. 2. Добавление Cl2NQ в присутствии AscH- вызывало уменьшение сигнала Р700+ и увеличение дублетного сигнала ЭПР, принадлежащего анион-радикалу Asc•-. Этот эффект можно объяснить тем, что Cl2NQ служит медиатором переноса электрона между терминальными кофакторами ФС 1 и окисленной формой аскорбата (Asc). 3. Результаты регистрации кинетики фотоокисления и темнового восстановления Р700+ показывают, что в присутствии Cl2NQ происходило ускорение фотоокисления Р700 по сравнению с контролем (без добавок). Однако скорость последующего темнового восстановления Р700+ в отсутствие аскорбата оставалась неизменной. 4. В присутствии AscH- добавление Cl2NQ значительно ускоряло темновое восстановление Р700+. Этот результат указывает на синергетическое действие Cl2NQ и аскорбата. 5. Возможной причиной отсутствия заметного ускорения темнового восстановления Р700+ может быть реокисление полувосстановленного Cl2NQ (семихинон Cl2NQ•-) молекулярным кислородом. Действительно, в анаэробных условиях мы наблюдали ускорение восстановления Р700+ в темноте по сравнению с аэрированными образцами. Таким образом, показано, что в условиях стационарного освещения не только МВ, но и Cl2NQ является эффективным экзогенным акцептором электрона от ФС 1. Способность восстановленного Cl2NQ донировать электрон на фотоокисленный Р700+ опосредована его взаимодействием с аскорбатом. 4. Кинетическая модель взаимодействия ФС 1 с водорастворимыми экзогенными донорами и акцепторами. Разработана кинетическая модель реакций переноса электрона в ФС 1, которая включала: прямые и обратные реакции переноса электрона между редокс-кофакторами А0↔А1↔Fx↔FA/FB с варьируемой активностью симметричных ветвей кофакторов А и В; рекомбинацию электрона с хинонов A1A и A1B на P700+; взаимодействие терминальных акцепторов ФС 1 с экзогенными акцепторами (растворенный молекулярный кислород и экзогенные акцепторы); донирование электрона на P700+ экзогенным донором DCPIP. Параметры модели были определены на основании глобального анализа совокупности данных, описанных в п.1. Анализ кинетических зависимостей с помощью разработанной модели позволил сделать следующие выводы: 1. Рекомбинация зарядов между терминальными железо-серными кластерами [FA/FB]- и Р700+ (в нативных комплексах) и между FX- и Р700+ (в комплексах FX-core) происходит через промежуточные стадии с участием восстановленного хинона в сайте А1. 2. На основании кинетического анализа были определены термодинамические параметры кофакторов ФС 1, а именно, константы равновесия отдельных реакций и редокс-потенциалы кофакторов в нативных и в структурно модифицированных комплексах. В интактной ФС 1 значение свободной энергии ΔG электронного перехода между FX и [FA/FB] составило -130 мэВ, между вторичным хинонным акцептором A1 в ветви А и FX - -50 мэВ. Величина ΔG между A1A и FX для PQ в ФС 1 из штамма menB, содержащего в сайте А1 PQ, составляет +45 мэВ, что создает энергетический барьер для переноса электрона на терминальные акцепторы FA/FB. Окислительно-восстановительный потенциал Cl2NQ в сайте A1A выше -400 мВ, что полностью предотвращает перенос электрона на терминальные акцепторы в модифицированном комплексе menB-Cl2NQ. 3. Результаты, полученные для комплекса ФС 1, содержащего Cl2NQ в сайте A1, показывают, что экзогенный акцептор МВ способен принимать электроны непосредственно от A1, минуя железо-серные кластеры. Однако из-за низкого значения константы Михаэлиса эта реакция не может эффективно конкурировать с рекомбинацией заряда от A1- к P700 + даже при высокой концентрации Cl2NQ. 4. Скорость взаимодействия экзогенных акцепторов МВ и кислорода с Cl2NQ в сайте A1 была крайне высокой, приближаясь к пределу диффузионно-контролируемых реакций. Побочная генерация супероксид-радикала в сайте А1 путем восстановления кислорода (реакция Мелера) может составлять ≥0,3% от общего потока электронов в ФС 1. Высокоэффективный перенос электрона на железо-серные кластеры в ФС 1 может служить эволюционной защитой против таких побочных реакций. 5. Оценены бимолекулярные константы скорости и константы диссоциации различных препаратов ФС 1 с экзогенными акцепторами МВ и Cl2NQ. Значения констант скорости переноса электрона от ФС 1 к МВ для интактного комплекса и ФС 1 из штамма menB были близки, их величина в 3 раза превышала соответствующую константу скорости для комплексов FX-core. Значения констант диссоциации для интактной ФС 1 и FX-core с Cl2NQ в качестве экзогенного акцептора были в 8 раз выше соответствующих констант диссоциации с МВ. 5. Взаимодействие водорастворимых спиновых меток (стабильные нитроксильные радикалы) с комплексами ФС 1 дикого типа, содержащими разное количество Fe-S кластеров, и мутантного штамма menB с различными хинонами в сайте А1. Для исследования эффективности взаимодействия различных препаратов ФС 1 с внешними акцепторами электрона нами были использованы водорастворимые нитроксильные радикалы (спиновые метки) двух типов: электронейтральная 4-амино-2,2,5,5-тетраметил-2,5-дигидро-1H-имидазол-1-оксил (ATI) и положительно заряженная 4-амино-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил (ТА). Поскольку, аскорбат способен восстанавливать парамагнитный фрагмент спиновых меток, а ферроцианид практически не влияет на интенсивность сигнала спиновых меток в растворе, в этой серии экспериментов ферроцианид был использован в качестве экзогенного донора электронов для Р700+. В ходе исследования акцепторных свойств водорастворимых спиновых меток нами были получены следующие результаты: 1. Измерения кинетики фотоиндуцированных изменений амплитуды сигналов ЭПР спиновых меток показали, что на свету в аэробной суспензии обе спиновые метки, АТI и ТА, практически не восстанавливаются. Это обусловлено тем, что в аэробных условиях скорость окисления акцепторов ФС 1 кислородом была гораздо выше, чем скорость переноса электрона к спиновым меткам. 2. В анаэробных условиях наблюдалась необратимая потеря парамагнетизма молекулами электронейтральных спиновых меток, обусловленная восстановлением их нитроксильных фрагментов. 3. Скорости восстановления радикалов зависели от типа радикала. Для положительно заряженной метки ТА мы не наблюдали восстановления метки ни в аэрированной, ни в деаэрированной среде. Для электронейтральной спиновой метки ATI было обнаружено фотоиндуцированное восстановление метки в анаэробных условиях. 4. Было обнаружено, что в случае интактных комплексов ФС 1 скорость восстановления метки была почти в два раза выше по сравнению с FX-core комплексов. Это может быть обусловлено более высокой доступностью железо-серных кластеров FA и FB по сравнению с кластером FX в FX-core, поскольку расстояние от FB до поверхности белка в интактных комплексах меньше, чем аналогичное расстояние от FX в FX-core комплексах, лишенных субъединицы PsaC и терминальных кластеров FAFB. 6. Исследование электрогенных реакций на донорном участке нативных и лишенных марганцевого кластера ядерных комплексах фотосистемы 2. 1) С помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих кислород-выделяющие ядерные комплексы из фотосистемы 2 (ФС 2) был изучен механизм генерации мембранного потенциала, обусловленной переходами между S-состояниями комплекса окисления воды (КОВ) в отсутствие и в присутствии дисахарида трегалозы. Продемонстрировано, что в адаптированных к темноте образцах в ответ на последовательные лазерные вспышки наблюдается быстрый рост мембранного потенциала, сопровождающийся дополнительным нарастанием в ответ на первые три вспышки. Наблюдаемые дополнительные электрогенные стадии переноса зарядов обусловлены S1 → S2, S2 → S3, и S4 → S0 переходами КОВ в отсутствие и в присутствии 1 М трегалозы и характеризуются одинаковой амплитудой. Показано, что в отличие от S1 → S2 перехода, обусловленного переносом электрона от иона марганца к редокс-активному радикалу тирозина YZ•, реакции выброса протонов из марганцевого кластера в водную фазу, обусловленные S2 → S3 и S4 → S0 переходами в КОВ ускоряются приблизительно в два раза. 2) С помощью прямого электрометрического метода был исследован механизм генерации трансмембранной разности электрических потенциалов на протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 2, не содержащие ионов марганца в присутствии синтетического 4-х ядерного марганцевого кластера с триподными тетрадентатными лигандами. Продемонстрировано, что в ответ на вспышку лазера в отсутствие экзогенных добавок происходит быстрое нарастание электрического потенциала за время более короткое, чем временное разрешение измерительной установки. Наблюдаемое быстрое образование фотопотенциала обусловлено переносом электрона от редокс-активного тирозина YZ к первичному хинонному акцептору электронов QA, а происходящий далее спад обусловлен рекомбинацией зарядов между первичным хинонным акцептором QA- и окисленным YZ. Добавление синтетического 4-х ядерного марганцевого кластера приводит к замедлению кинетики спада фотоэлектрического ответа и появлению дополнительной миллисекундной фазы нарастания фотопотенциала с амплитудой около 25% от общей амплитуды. Полученные результаты впервые демонстрируют быстрый и эффективный перенос электрона от синтетического марганцевого кластера, внутри белкового матрикса реакционного центра ФС 2 к окисленному радикалу тирозина YZ. Эти результаты важны для понимания молекулярного механизма образования разности электрических потенциалов на донорном участке ФС 2.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. 2
Результаты этапа: Пигмент-белковые комплексы фотосистемы 1 (ФС1) и фотосистемы 2 (ФС2) являются универсальными биологическими преобразователями солнечной энергии. В природе эти комплексы являются функциональной частью фотосинтетической электрон-транспортной цепи, важнейшим компонентом которой являются подвижные переносчики электронов между комплексами. Эти переносчики осуществляют окисление терминальных кофакторов электронного транспорта в комплексах ФС1 и ФС2 и восстановление фотоокисленных первичных доноров электронов. Важной и актуальной проблемой как в области изучения молекулярных механизмов переноса электрона в этих комплексах, так и в области их возможного применения в качестве искусственных высокоэффективных преобразователей солнечной энергии, является изучение их взаимодействия с донорами и акцепторами электронов. В ходе выполнения работ по проекту в 2018 году нами были продолжены исследования взаимодействия выделенных пигмент-белковых комплексов ФС1 и ФС2 с экзогенными донорами и акцепторами электронов в различных условиях. Исследования проводились как с помощью биофизических методов, так и методами молекулярной динамики, которые позволили промоделировать некоторые из механизмов взаимодействия ФС1 с экзогенными акцепторами электронов. Особое внимание было уделено экспериментальному изучению взаимодействия лишенных марганцевого кластера комплексов ФС2 (апо-КОВ-ФС2) с искусственными донорами электронов. Исследования выполнены путем регистрации кинетики фотоиндуцированных изменений флуоресценции, прямого электрометрического метода и импульсной абсорбционной спектроскопии. Влияние синтетических Mn-содержащих комплексов [Mn(III)Mn(III)(HNQOX)4(OAc)2] (М-2) и [Mn(III)-O-Mn(III)(HNQOX)2(OAc)2(H2O)2] (М-3) на процессы восстановления редокс-активного тирозина YZ и фотоокисление первичного хинонного кофактора QA было сопоставлено с действием MnCl2. В ходе исследований была продемонстрирована большая донорная эффективность комплекса М-3 по сравнению с М-2 и MnCl2. В кинетике нарастания мембранного потенциала, индуцированного лазерными вспышками, помимо быстрого разделения зарядов, были дополнительно обнаружены более медленные электрогенные фазы, обусловленные переносом электронов от синтетических Mn-содержащих комплексов на YZ. Показано, что добавление этих соединений не влияет на процессы, протекающие на акцепторной стороне ФС2. Интересным результатом является обнаружение эффекта ацетата натрия, вызывающего ускорение переноса электрона от YZ к фотоокисленному первичному донору электронов ФС2 Р680+ в препаратах апо-КОВ-ФС2. Предполагается, что добавленный ацетат натрия является акцептором протона, донируемого YZ, что облегчает перенос электрона на Р680+. Взаимодействие ядерных комплексов ФС2 с экзогенными акцепторами электронов было исследовано с помощью прямого электрометрического метода. Это позволило выявить наличие дополнительных электрогенных реакций, сопровождающих восстановление 2,6-дихлоро-п-бензохинона (DCBQ) и окисленной формы цитохрома с. Взаимодействие комплексов ФС2 с экзогенными акцепторами электронов изучалось также в условиях стационарного освещения с помощью метода ЭПР. Было выявлено восстановление отрицательно заряженных и полярных водорастворимых спиновых меток Tacet и NTI на акцепторной стороне ФС2 и предложен механизм такого взаимодействия. Взаимодействие комплексов ФС1 из Synechocystis sp. PCC 6803 с различными редокс-медиаторами было охарактеризовано в условиях импульсного освещения. Методом импульсной абсорбционной спектроскопии на длине волны 820 нм было обнаружено акцепторное действие окисленной формы аскорбата натрия, образующейся при окислении аскорбата ФС1. Детально изучено влияние соотношения окисленных и восстановленных форм 2,6-дихлорфенолиндофенола (DCPIP) и N,N,N’,N’-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD) на кинетику переноса электрона в ФС1. Это соотношение, по-видимому, оказывает существенное влияние на процессы окисления и восстановления первичного донора электронов Р700 ФС1 на стационарном свету. Нами было изучено влияние DCPIP на эти процессы и стационарную концентрацию Р700+ при освещении с помощью метода ЭПР. Показано, что акцепторная эффективность DCPIP выше, чем донорная. Кроме того, с помощью полярографии было выявлено взаимодействие DCPIP с молекулярным кислородом. Таким образом, DCPIP является соединением, опосредующим как перенос электрона от восстановленного аскорбата натрия к Р700+, так и перенос электрона от терминальных кофакторов ФС1 к молекулярному кислороду. В условиях стационарного освещения нами была изучена имеющая важное физиологическое значение реакция ФС1 с молекулярным кислородом. При этом были сопоставлены измеренные полярографически зависимости скорости восстановления кислорода комплексами ФС1 из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, содержащие нативный филлохинон или встроенный пластохинон (мутантный штамм menD). Было показано, что комплексы ФС1, содержащие пластохинон, восстанавливают молекулярный кислород более эффективно, чем нативные комплексы ФС1 из дикого типа. Исследованы индуцированные лазерными вспышками электрогенные реакции переноса электрона в комплексах ФС1 из мутантного штамма menB цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, содержащих пластохинон и встроенных в липосомы в присутствии акцептора электронов метилвиологена. Оценен вклад электрогенной компоненты переноса электрона от хинонных кофакторов ФС1 на железо-серные кластеры в общий электрогенез в ФС1. В ходе выполнения работ по проекту в 2017 году нами были получены данные о прямом взаимодействии хинонного кофактора ФС1 с экзогенным акцептором электронов метилвиологеном. С целью дальнейшего изучения механизма этой реакции была начата работа по характеризации взаимодействия содержащих замещенные хинонные кофакторы комплексов ФС1 и акцептора электронов бензилвиологена. Взаимодействие содержащих замещенные хиноны комплексов ФС1 с метилвиологеном было изучено в условиях стационарного освещения методом ЭПР. Было показано, что в содержащих комплексах ФС1, содержащих в сайте А1 высокопотенциальное производное нафтохинона 2,3-дихлор-1,4-нафтохинон (Cl2NQ), восстановление метилвиологена хинонным кофактором приводит к увеличению стационарной концентрации фотоокисленного первичного донора электронов ФС1 (Р700+). Важным шагом на пути изучения функционирования ФС1 in situ является изучение структурных перестроек в липидной фазе мембраны, окружающей пигмент-белковый комплекс. Изучение этих процессов возможно с использованием гидрофобных спиновых зондов (СЗ) на основе стеариновой кислоты (СЗ типа n-SASL). Однако важно исключить восстановление этих зондов от кофакторов ФС1. Путем анализа ЭПР-сигнала СЗ в присутствии встроенных в липосомы комплексов ФС1 нами было показано отсутствие взаимодействия ФС1 и зондов. В ходе работы по проекту в 2018 году нами было исследовано влияние температуры на кинетику переноса зарядов в интактных комплексах ФС1 и в FX-core комплексах, не содержащих терминальные Fe4S4 кластеры FA/FB. Анализ кинетики рекомбинации зарядов при разных температурах позволил приписать кинетические компоненты реакциям, соответствующим обратному переносу электронов от различных акцепторов на фотоокисленный Р700. Определены кинетические и термодинамические параметры при разных температурах. Показано, что кинетика рекомбинации зарядов с Fe4S4 кластеров является неэкспоненциальной при температурах ниже 200 К как для интактных, так и для FX-core комплексов. Продемонстрированы два пути рекомбинации с терминальных кластеров FA/FB – прямой через кластер FX (при температуре выше 270 К) и опосредованный через FX и хинонный акцептор A1A (в диапазоне 200 – 260 К) с энергиями активации Ea 270 мэВ и 30 мэВ, соответственно. Кинетика обратного переноса электрона при температурах ниже точки стеклования смеси вода-глицерин (170 К) была безактивационной. Сравнение кинетик переноса электронов в ФС1 при температурах ниже 200 К и при иммобилизации в высушенной трегалозной матрице при комнатной температуре показало как сходство, так и некоторые различия эффектов ограничения конформационной подвижности белка в этих условиях. Показано, что при понижении как температуры, так и влажности происходит последовательный рост вклада рекомбинации с кластера FX и хинона А1 за счет уменьшения рекомбинации с кластеров FA/FB на фотоокисленный Р700. С использованием полученных ранее данных была построена молекулярно-динамическая модель цианобактериальной ФС1, погруженной в бислойную липидную мембрану. С помощью этой модели была изучена возможность прямого восстановления акцептора электронов Cl2NQ с хинонным кофактором в сайте связывания А1 ФС1. Показано, что Cl2NQ способен образовывать водородные связи с аминокислотой GLY50 субъединицы Е ФС 1, что обеспечивает его фиксацию во внутрибелковой водной полости вблизи сайта А1А. Таким образом, подтверждена возможность докинга Cl2NQ на расстоянии ~9 Å от сайта связывания хинона А1А, что обеспечивает возможность эффективного переноса электрона от А1А непосредственно на экзогенный акцептор при затрудненном переносе электрона на железо-серные кластеры. Моделирование также показало, что помещенный в ту же водную полость молекулярный кислород стабильно удерживается на расстоянии ~8,4 Å от хинона А1А и поэтому может служить эффективным акцептором электрона от хинонного кофактора. Важным результатом с точки зрения описания процессов переноса электрона в комплексах ФС1 является расчет возможных путей рекомбинации электрона с хинонов А1А/А1В. Для обнаруженных асимметричных путей количественно оценены факторы электронного сопряжения между P700 и А1А/A1B, которые составили 0.13 и 2.3 мкэВ. Полученные оценки факторов сопряжения согласуются с экспериментально наблюдаемой разницей скоростей рекомбинации электрона с хинонов А1А и А1В на фотоокисленный димер молекул хлорофилла Р700.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. 3
Результаты этапа: C помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы фотосистемы 2 (ФС 2) из шпината был изучен прямой перенос электрона от восстановленного первичного хинонного акцептора QA к окисленному цитохрому с (цит с3+) при однократном срабатывании реакционного центра (РЦ). В присутствии цит с3+ (20 мкМ) в ответ на единичные вспышки лазера регистрируется кинетика генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (∆ψ). В этой кинетике, помимо быстрой неразрешимой электрогенной фазы, обусловленной переносом электрона от редокс-активного тирозина YZ к первичному хинонному акцептору QA (< 0.2 мкс), появляется дополнительная фаза нарастания с характерным временем около 40 мкс и амплитудой около 10% при рН=7.5. Выявление эффективного векторного прямого переноса электрона от QA на цит с3+ в комплексах ФС 2 из растений, представляется важным для использования такой системы при разработке гибридных преобразователей солнечной энергии в электрическую форму. Целью дальнейшей работы являлась иммобилизация кислород-выделяющих ядерных комплексов ФС 2 в присутствии дисахарида трегалозы на полупроводниковом электроде из оксидов индия и олова (ITO) и дальнейшая регистрация ∆ψ при стационарном освещении с помощью электрометрического метода. В качестве мезопористых структур были использованы нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,22 мкм. Включение белого света приводило к генерации ∆ψ и выходу разности потенциалов на стационарный уровень величиной около 40 мВ. Такая гибридная система позволяет регистрировать образование ∆ψ без видимой потери активности в течение, по меньшей мере, 4 ч при инкубации при комнатной температуре в темноте. ITO-электроды с кислород-выделяющими ядерными комплексами ФС 2 способны регистрировать светозависимое образование разности электрических потенциалов вследствие разделения зарядов в РЦ ФС 2, последующего восстановления первичного донора электрона Р680 за счет окисления воды и инжектирования электрона от первичного хинонного акцептора QA в зону проводимости полупроводника ITO с участием редокс-медиатора 2,6-диметил-1,4-бензхохинона. В продолжение исследований, выполненных ранее, на 2019 год было запланировано провести исследование фотоиндуцированных редокс-превращений спиновых меток различной природы с изолированными белковыми комплексами ФС 1 и ФС 2. Спиновыми зондами обычно называют производные стабильных нитроксильных радикалов, растворяемых в липидной фазе мембраны; к спиновым меткам относят производные нитроксильных радикалов, ковалентно связываемых с белками, которые служат индикаторами структурных перестроек белков. Было изучено взаимодействие липидорастворимых спиновых зондов – спин-меченых производных стеариновой кислоты (5-доксилстеарат, 5-SASL, или 16-доксилстеарат, 16-SASL) – с протеолипосомами, содержащими ФС 1 или ядерные комплексы ФС 2. Характерная форма спектров ЭПР спиновых зондов в суспензии протеолипосом свидетельствовала о том, что молекулы зондов растворялись в гидрофобной фазе мембраны. Подчеркнем, что при этом не наблюдалось фотоиндуцированного восстановления молекул зондов от ФС 1 или ФС 2. Можно сделать вывод, что нитроксильные фрагменты зондов, локализованные внутри липидного бислоя протеолипосом, удалены от акцепторных участков электрон-транспортных цепей ФС 1 и ФС 2 на достаточно большое расстояние (~50-65 Å), препятствующее переносу электрона от редокс-кофакторов ФС 1 и ФС 2 к нитроксильным радикалам гидрофобных спиновых зондов. В качестве спиновых меток, связываемых ковалентно с ФС 1 или ФС 2, были использованы: а) иод-ацетамидная спиновая метка и б) малеимидная спиновая метка. Интенсивность сигнала ЭПР ковалентно-связанной иод-ацетамидной метки была заметно ниже интенсивности сигнала связанной малеимидной метки. По этой причине основное внимание было уделено изучению спектров ЭПР малеимидной метки. Нами было зарегистрировано появление фотоиндуцированного сигнала ковалентно-связанной малеимидной метки только в случае ФС 2, что свидетельствует о ее восстановлении от редокс-кофакторов ФС 2, наиболее вероятно от пластосемихинона QA. Отсутствие фотоиндуцированного сигнала метки в случае ФС 1, вероятно, обусловлено удаленностью сайта связывания метки от терминальных редокс-кофакторов электрон-транспортной цепи ФС 1 (30-50 Å). В качестве экзогенного донора для изолированных комплексов ФС 1 традиционно используется редокс-пара, состоящая из аскорбата (Аск) и медиатора, чаще всего 2,6-дихлорфенолиндофенола (DCPIP) или N,N,N’,N’-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD), который служит переносчиком электрона от Аск на окисленный первичный донор электронов в ФС 1, Р700+. В 2019 году на основе анализа зависимости кинетики восстановления Р700+ от концентрации редокс-медиаторов было продемонстрировано, что в условиях импульсного освещения DCPIP, TMPD и Аск также являются эффективными акцепторами электронов. DCPIP демонстрирует самую высокую акцепторную эффективность, которая существенно зависит от присутствия кислорода в среде. Окисленная форма Аск является наименее эффективным акцептором, скорость ее восстановления железо-серными кластерами низка как в интактных комплексах, так и в комплексах FX-core, лишенных терминальных 4Fe-4S кластеров FA/FB. Это проявляется в том, что скорость восстановления окисленного Аск низка по сравнению со скоростью обратного переноса электрона в комплексах FX-core. Сопоставление взаимодействия комплексов ФС 1 с Аск в условиях импульсного и стационарного освещения позволило выявить различие в механизмах переноса электрона в ФС 1 в зависимости от типа освещения. Получены указания на то, что в условиях стационарного освещения наблюдается перевосстановление кофакторов электрон-транспортной цепи ФС 1, которое препятствует рекомбинации и увеличивает время жизни терминальных редокс-кофакторов на акцепторном участке в заряженном состоянии. Эти предположения согласуется с нашими предыдущими данными об участии филлохинона в сайте А1 в восстановлении кислорода от ФС 1 при высокой интенсивности освещения. В настоящей работе нами была более детально исследована роль филлохинона в этом процессе. Для этого была изучена зависимость кажущейся константы скорости реакции восстановления кислорода в ФС 1 (k2) от интенсивности света. Величину k2 оценивали по скорости поглощения кислорода в суспензии ФС 1 в условиях пониженной концентрации кислорода (10-30 мкМ). Такие зависимости регистрировали в суспензии интактных комплексов ФС 1 в присутствии и в отсутствие медиатора эффективного переноса электрона от FA/FB к молекулам O2 - метилвиологена. Кроме того, были сопоставлены зависимости величины k2 от интенсивности света для комплексов ФС 1 с различным числом 4Fe-4S кластеров (интактных, FX-core и лишенных всех трех 4Fe-4S кластеров A1-core комплексах). Полученные данные указывают на существование различных редокс-кофакторов, участвующих в восстановлении кислорода в ФС 1. Наибольший вклад в восстановление кислорода при высоких интенсивностях света во всех типах исследованных нами комплексов вносит филлосемихинон в сайте А1. Взаимодействие ФС 1 с молекулярным кислородом представляет особый интерес с точки зрения оценки скорости фотогенерации активных форм кислорода в процессе фотосинтеза. Методом потенциала средней силы (PMF) был рассчитан энергетический профиль для движения молекулы кислорода вдоль водного канала вблизи сайта вторичного акцептора электронов филлохинона А1 в ФС 1. Были получены оценки изменения энтальпии, трансляционной и вращательной энтропии при связывании кислорода в этом кармане. Показан существенный вклад гидрофобных взаимодействий в свободную энергию связывания.Оценка общей энергии связывания молекулярного кислорода составила –(10-19) кДж/моль. С помощью программы AutoDock Vina проведен докинг 2,3-дихлор-нафтохинона на поверхности ФС 1 и получены оценки энергии связывания для обнаруженных потенциальных сайтов связывания. С помощью данной программы были найдены альтернативные сайт связывания кислорода и 2,3-дихлор-нафтохинона вблизи железо-серных кластеров в акцепторной части ФС 1. Были рассчитаны молекулярные потенциалы метилвиологена в силовом поле Amber. В случае продолжения проекта они будут использованы для молекулярно-динамического моделирования взаимодействия фотосистемы 1 с метилвиологеном.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".