Изучение функции пептидов, закодированных в длинных некодирующих РНК на примере Linc1500011k16Rik M. musculusНИР

The function of the peptides that are encoded in lncRNAs as an example of Linc1500011k16Rik M. musculus

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 27 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. Изучение функции пептидов, закодированных в длинных некодирующих РНК на примере Linc1500011k16Rik M. musculus
Результаты этапа: Таким образом, на этапе 2017 года мы доказали существование пептида L116, продукта экспрессии гена 1500011k16Rik. Оказалось, что уровень эндогенной экспрессии достаточно низкий, но присутствие пептида можно детектировать при помощи иммуноблоттинга с анти-L116 антителами, после обогащения фракции митохондрий. Также можно было наблюдать митохондриальную локализацию эндогенного белка в виде гибрида с mCherry. Для исследования функциональной значимости гена L116 созданы нокаутные линии клеток, фенотип которых предстоит изучить на этапе 2018 года. Для определения партнеров L116 планируется использовать линии с суперэкспрессией гена гибридного белка HA-L116.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Изучение функции пептидов, закодированных в длинных некодирующих РНК на примере Linc1500011k16Rik M. musculus
Результаты этапа: Цель исследования - установить функции пептида L116, закодированного в транскрипте, считавшемся длинной некодирующей РНК Linc1500011k16Rik M. musculus. Его эквивалент у человека имеет название LINC00116, поэтому пептид, для краткости, будем называть L116. Напомним, что в прошлом 2017 году были созданы линии клеток NIH3T3, в которых ген, кодирующий пептид L116 был инактивирован и линии клеток NIH3T3, в которых был привнесен ген гибридного белка HA-L116 под контролем гибридного доксициклин-индуцируемого промотора на основе промотора RPBSA. В 2018 году, дополнительно к созданным ранее нокаутным линиям на основе NIH3T3 мы также создали нокаутные по гену 1500011k16Rik линии клеток на основе суспензионной культуры NS0. Для этого мы использовали систему CRISPR/Cas9 и набор из двух гидовых РНК, направляющих разрезание гена 1500011k16Rik по участкам, соответствующим N- и С-концам пептида L116. Отбор и проверка клонов осуществлялись также, как это было сделано раньше для адгезивной культуры NIH3T3. В результате мы отобрали клон линии NS0 с полным удалением кОРС в гене 1500011k16Rik (Рис. 1). Для того чтобы оценить влияние L116 на активность комплексов дыхательной цепи мы воспользовались изменением скорости поглощения кислорода с помощью электрода Кларка. При этом мы проводили сравнение убыли концентрации кислорода в суспензии клеткок дикого типа и нокаутных по гену 1500011k16Rik, добавляя специфические субстраты и ингибиторы отдельных комплексов дыхательной цепи. Скорость поглощения кислорода дает оценку потока электронов через комплексы I-IV дыхательной цепи (Рисунок 3а). Оказалось, что активность больей части комплексов дыхательной цепи не чувствительна к инактивации гена 1500011k16Rik. Исключением явилась активность NADH убихинон оксиредуктазы, т.н. комплекса I. Для измерения активности этого комплекса используются глутамат и малат в качестве субстратов. Эти соединения попадают внутрь митохондрии через систему антипортеров и превращаются в матриксе митохондрии в NADH, окисляемый комплексом I. Добавление специфического ингибитора работы комплекса I, ротенона, позволяло оценить, какую долю общего поглощения кислорода обеспечивает комплекс I. Оказалось, что эффективность работы комплекса I существенно ниже при удалении L116. Результат был воспроизведен в обеих клеточных линиях. Чтобы удостовериться в том, что наблюдаемые изменения активности комплекса I при инактивации гена 1500011k16Rik не связаны со случайными (off-target) мутациями, вызванными CRISPR-Cas9 системой, мы сделали контроль с помощью генетической комплементации. В этом эксперименте нокаутную клеточную линию трансфецировали экспрессионной конструкцией на основе транспозонного вектора, несущей L116 или люциферазу, и плазмидой, кодирующей транспозазу sleeping beauty. Оказалось, что экспрессия гена 1500011k16Rik, кодирующего L116, но не гена кодирующего люциферазу, восстанавливала способность комплекса I проводить восстановление кислорода с использованием глутамата и малата в качестве субстратов (Рисунок 3б). Для понимания функции пептида L116 необходимо было определить, с какими белками совыделяется этот пептид. Известно, что малые пептиды к клетках, как правило не имеют самостоятельной функции, но образуют комплексы с более крупными белками. Для поиска белковых партнеров пептида L116 мы создали линию клеток с эктопической экспрессией гена L116 с HA-эпитопом при помощи вектора, встраиваемого в геном транспозазой sleeping beauty. В качестве контроля мы создали аналогичную линию клеток со встроенным геном L116 без аффинного эпитопа. Клетки созданных линий были выращены, использованы для приготовления экстрактов и последующей иммунопреципитации с помощью иммобилизованных анти-НА антител. Воспроизводимо и достоверно с L116 совыделялась NADH-зависимая цитохром b5 редуктаза 3 (Cyb5r3) (Рисунок 4а, б). Поскольку линия для иммунопреципитации L116 имела НА-довесок, присоединенный к L116, а контрольная линия не имела этого довеска, было теоретически возможно, хотя и маловероятно, что Cyb5r3 взаимодействует не с L116, а с НА-довеском. Для того, чтобы исключить такую возможность, мы провели иммунопреципитацию другого гибридного белка, L116-mCherry, из клеток, в геном которых была встроена соответствующая конструкция. В этом случае иммунопреципитация проводилась с использованием совершенно других антител, а именно антител к mCherry. Как и в случае с иммунопреципитацией гибрида HA-L116 с помощью анти-НА антител, в результате иммунопреципитации L116 за довесок mCherry нам удалось специфично выделить Cyb5r3 (Рисунок 4в). При разрушении клеток компоненты разных внутриклеточных компартментов могут взаимодействовать друг с другом давая иллюзию, что такое взаимодействие осуществляется и в клетке. Для исключения такой возможности мы проверили, локализуются ли L116 и Cyb5r3 в одном компартменте. Для этого мы создали линию клеток NIH3T3, в которой мы экспрессировали L116-mCherry и Cyb5r3-eGFP одновременно (Рисунок 4г). Оказалось, что L116 колокализуется с Cyb5r3 в митохондриях, что дополнительно свидетельствует о том, что взаимодействие этих белков не является артефактом, и происходит в живых клетках. Таким образом, на этапе 2018 года мы показали, что инактивация гена 1500011k16Rik, кодирующего пептид L116, в каждой из двух клеточных линий мыши, использованных в данной работе, NIH3T3 и NS0, приводит к ингибированию активности убихинон:NADH дегидрогеназы, комплекса I дыхательной цепи, но не активности других комплексов дыхательной цепи. С помощью иммунопреципитации гибридного белка HA-L116 с аффинным довеском мы обнаружили, что L116 взаимодействует с NADH-зависимой цитохром b5 редуктазой 3.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Изучение функции пептидов, закодированных в длинных некодирующих РНК на примере Linc1500011k16Rik M. musculus
Результаты этапа: На этапе 2019 года мы показали, что L116, пептид закодированный в гене 1500011k16Rik, влияет на активность комплекса I дыхательной цепи митохондрий опосредованно. Мутация, нарушающая митохондриальную локализацию NADH-зависимой цитохром b5 редуктазы 3 (Cyb5r3), партнера L116, также приводит к нарушению активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий. При этом, отсутствие L116 не нарушает способность Cyb5r3 использовать NADH. Как инактивация L116, так и мутация, нарушающая митохондриальную локализацию белка Cyb5r3, приводят к сходному изменению липидного состава клеток. Мы полагаем, что изменение липидного состава митохондриальной мембраны является причиной ингибирования работы комплекса I при инактивация гена L116.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".