ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной проблемы по созданию нового типа металлоорганических соединений с противоопухолевой активностью. В ходе выполнения проекта предполагается получение физиологически активных би- и триядерных соединений металлов, содержащих в своей структуре металлоценовый и метал-ареновый фрагменты и обладающих выраженной антипролиферативной и/или антиметастатической активностью. Создание таких структур позволит изучить влияние редокс-активного металлоорганического центра, числа металлоорганических центров и природы металла/металлов, входящих в состав молекул данных соединений на биологическую (антипролиферативную) активность по отношению к раковым клеточным культурам. Полученные соединения позволят изучить механизм антипролиферативного действия, выявляя воздействие как на уже известные биомишени, так и предложить новые мишени, на которые будут воздействовать данный класс соединений.

The project is aimed at solving fundamental problems on creation of a new type of organometallic compounds with antitumor activity. In the course of the project it is expected to obtain physiologically active bi - and three-nuclear metal compounds containing in the structure a metallocene and metal-arene fragments and with pronounced antiproliferative and/or anti-metastatic activity. The creation of such structures will allow to study the influence of redox-active organometallic centre, the number of organometallic centers and the nature of the metal/metals that are included in the molecules of these compounds for biological (antiproliferative) activity against cancer cell cultures. The compounds obtained will allow to study the mechanism of antiproliferative action, identifying the impact on already known biological target and propose new targets, which will impact this class of compounds.

Создание нового типа металлоорганических соединений с противоопухолевой активностью, содержащих металлоценовый и метал-ареновый фрагменты.

Поиск и систематизация необходимой научной литературы.

В данной работе проведено сравнительное исследование антиоксидантной и антигликирующей активности и установления влияния металлоорганического фрагмента на примере оснований Шиффа на основе известного антиоксиданта - 2,6-ди-трет-бутилфенола, содержащих в пара-положении фрагменты пиридина (1,2) или ферроцена (3). Антиоксидантную активность соединений 1-3 оценивали с помощью метода ABTS на примере модельной реакции, основанной на способности антиоксидантов восстанавливать стабильный катион-радикал 2,2-азинобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) – ABTS˙+. В качестве соединения сравнения использовали тролокс – функциональный фрагмент природного липофильного антиоксиданта α-токоферола (витамина Е). Полученные значения IC50 показывают, что активность соединения 3, содержащего ферроценильную группу, превышает активность фенолов 1 и 2 в ~ 7,5 и 14 раз соответственно. Важно отметить, что активность соединения 3 по величине IC50 также превышает активность эталонного антиоксиданта тролокса в 4,3 раза. Столь существенное возрастание активности ферроценильного производного 3 может являться следствием внутримолекулярных редокс-процессов в феноксильном радикале 3’, ответственным за проявление антиоксидантных свойств. При наличии системы сопряжения ферроценильная группа, по-видимому, выступает в качестве внутримолекулярного восстановителя нейтральной (радикал) или заряженной (катион-радикал) частиц, обеспечивая, таким образом, большее число циклов при действии антиоксиданта. С целью установления вклада различных механизмов антиоксидантного действия для соединения 3 проведен комплекс исследований с использованием набора методов, определяющих возможные механизмы активности. К таким механизмам относятся следующие: (1) перенос атома водорода, определяемый с помощью ДФПГ–теста на примере реакции со стабильным радикалом 1,1-дифенил-2-пикрилгидразилом и радикалом •OH; (2) перенос электрона с участием фенольной или ферроценильной группы, определяемый с помощью CUPRAC-теста, который основан на способности антиоксиданта восстанавливать ион меди(II) в комплексе с неокупроином, в реакции с H2O2, а также с помощью ферментативного метода, основанного на взаимодействии с супероксид анион-радикалом в системе ксантин/ксантиноксидаза; (3) ингибирование цепного радикального процесса пероксидного окисления ненасыщенного субстрата на примере линолевой кислоты, входящей в состав липидов. С целью подтверждения эффективности соединения 3 не только в модельных реакциях, но и в экспериментах in vitro, проведено исследование его действия на процесс пероксидного окисления липидов гомогенатов печени и митохондрий, изолированных из печени крыс. Результаты, полученные при изучении влияния соединений 1-3 на аскорбат-зависимое пероксидное окисление липидов печени подтверждают несомненное преимущество 3 при всех исследуемых концентрациях по сравнению с его аналогами 1 и 2, не содержащих ферроценильной группы. Однако значение IC50 на порядок ниже, чем таковое для тролокса. Одной из основных физиологических функций печени является детоксикация, в сязи с чем гомогенат печени содержит значительное количество цитозольных белков, способных связывать экзогенные соединения, которые в интактной клетке локализованы в специализированных органеллах. Поскольку основным участком продукции свободных радикалов в клетке являются митохондрии, в работе исследовано влияние соединения 3 на ПОЛ мембран изолированных митохондрий печени крыс. В качестве индукторов ПОЛ использовали как tBuOOH, так и Fe+3. В условиях эксперимента тролокс проявляет антиоксидантный эффект, сравнимый с наблюдаемым для гомогената печени. Значения IC50 составляют 4,94±0,93 и 5,79±0,90 µM для тБГП- и Fe+3-индуцированного ПОЛ, соответственно. Соединение 3, в отличие от тролокса, не подавляет ПОЛ, индуцированное tBuOOH, до концентрации 100 µM, но проявляет значительный антиоксидантный эффект по отношению к Fe+3-индуцированному ПОЛ: значение IC50 лежит в наномолярном диапазоне и составляет 31,2±17,0 нМ, что на два порядка ниже значения IC50 для тролокса в аналогичных условиях и на три порядка ниже соответствующего показателя в случае аскорбат-инициированного ПОЛ гомогената печени. Совокупность результатов, подтверждающих высокую эффективность действия 2,6-ди-трет-бутилфенола 3, содержащего ферроценильную группу, позволяет предполагать его способность проявлять активность в качестве антигликирующего агента. С этой целью изучен процесс гликозилирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой в присутствии соединений 1-3 в сопоставлении с аминогуанидином. Антигликирующая активность аминогуанидина составляет 70,7 %, в то время как соединение 3 ингибирует данный процесс полностью (100 %). Важно отметить, что 2,6-ди-трет-бутилфенолы 1 и 2 не только не проявляют активности в процессе гликозилирования, но и промотируют его. Для замещенного 2,6-ди-трет-бутилфенола, содержащего фрагмент ферроцена, определены острая токсичность на белых нелинейных мышах-самках при внутрибрюшинном введении соединения 3 в сопоставлении с аминогуанидином. Гибель животных и потенциальную токсичность регистрировали в течение 14 дней. При этом рассчитывали величину токсикологического показателя LD50, показатели эффективной концентрации IС50 антигликирующей активности, а также условный терапевтический индекс, являющийся отношением показателя LD50 к IС50 антигликирующей активности. Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что соединение 3 уступает аминогуанидину по значению терапевтического индекса, однако существенно превосходит аминогуанидин по величинам токсикологического показателя LD50 и эффективной концентрации IС50.Таким образом, предлагаемый подход, основанный на введении в молекулу антиоксиданта 2,6-ди-трет-бутилфенола фрагмента ферроцена может представлять интерес для создания эффективных ингибиторов гликозилирования белков, а, следовательно, для поиска новых препаратов для терапии заболеваний, в патогенез которых вовлечен процесс неферментативного гликозилирования. Один из подходов в создании лекарственных препаратов включает коструирование соединений из структурных блоков, которые обладают независимой биологической активностью. В качестве координирующего фрагмента был выбран имидазол, который способен связываться с атомом рутения. Через линкер посредством образования аммида имидазол связан с фрагментом ферроцена. Таким образом молекула включает рутениевый центр, имидазольный линкер и фрагмент биологически активной субстанции. Создание таких производных рутения с ферроценсодержащими лигандами позволяет модулировать их активность и дополняет свойства рутения легко осуществимыми обратимыми ред-окс-превращениями атома железа в ферроценильной группе. Легко протекающие обратимые окислительно-восстановительные превращения ферроценильной группы могут сыграть роль в регуляции окислительно-восстановительных превращений в живой клетке. На первом этапе были получены лиганды на основе ферроцена, реакцией хлорангидрида полученного in situ, с N-аминоимидазолом. Комплексы представляют собой устойчивые на воздухе порошкообразные вещества оранжевого цвета, хорошо растворимые в этаноле и ДМСО, умеренно растворимые в хлороформе и практически нерастворимые в эфире и петролейном эфире. Важно отметить, что растворы этих комплексов в ДМСО стабильны. Спектры ЯМР 1Н растворов этих комплексов в ДМСО-d6 остаются неизменными при комнатной температуре в течение 72 часов. Цитотоксичность соединений 4-6, 9-14 по отношению к клеточным линиям аденокарциномы толстой кишки человека SW480 и аденокарциномы молочной железы человека MCF7 была определена методом МТТ. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержащей 5%-ную эмбриональную сыворотку телят («РАА», Австрия) и гентамицин (50 ед/мл) («Paneco», Россия) при 37°С и в 5%-ном СО2. В качестве препарата сравнения был использован цисплатин. Наибольшую активность по отношению к клеткам аденокарциномы толстой кишки человека SW480 проявил комплекс рутения 14 (IC50 9.1±2.5 мкМ). По отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека MCF7 наибольшую цитотоксичность проявил комплекс рутения1 (IC509.5±3.5 мкМ). Таким образом, катионные комплексы рутения с ферроценильными лигандами проявляют антипролиферативную активность, сравнимую с активностью цисплатина. Помимо введения молекулы ферроцена в качестве лигандов были использованы производные бексаротена и лонидамина. Для понимания механизмов взаимодействия соединений Ru с биологическими мишенями, а также механизма метаболизма противораковых соединений необходима оценка их стабильности в водных растворах. Для комплексов 5-8 спектрофотометрически определяли время полупревращения в фосфатном буфере (pH 7.4 и 6.0). Для каждого комплекса записывали электронный спектр поглощения через равные промежутки времени (1, 2 или 5 мин). Затем для λmax строили зависимость ΔA(t), начальный участок аппроксимировали как линейную функцию. Время полугидролиза (t1/2) определяли как значение t в точке Aлин./2. Наиболее устойчивыми являются комплексы Ru(III) на основе амидов бексаротина 19 и 20. При pH7.4 данные соединения обладают большей стабильностью по сравнению с 21 и 22. Все исследуемые соединения обладают большей устойчивостью в кислой среде по сравнению с физиологическим значением pH. Эти данные согласуются с исследованиями гидролиза перспективного препарата - соединения NAMI-A (имидазолиум транс-имидазол тетрахлоро диметилсульфоксидрутенат(III)). Одним из маршрутов трансформации координационных соединений в организме может быть восстановление биологическими восстановителями. Восстановление комплексов 19-22 аскорбиновой кислотой было изучено спектрофотометрически. Ввиду того, что данные соединения повергаются гидролизу, реакцию восстановления проводили в фосфатном буфере при pH=6, т.е. в условиях при которых вещества наиболее стабильны. Соединения 19-22 восстанавливаются аскорбиновой кислотой с высокой скоростью, что регистрируется спектрально. При изучении лигандов 15-18 как ингибиторов глутатионредуктазы (рис. 3) значение IC50 > 100μM. В то же время комплексы Ru(III) (19-22) оказались эффективными ингибиторами фермента глутатионредуктаза, значения IC50 лежат в пределах 20-40μM. Таким образом, можно сделать вывод, о том, что ключевую роль в ингибировании фермента играет ион металла, присутствующий в комплексе, его степень окисления и геометрия комплекса. При этом для NAMI-A IC50 >50 μM, что указывает на непосредственную связь «структура лиганда – активность». Более активными ингибиторами глутатионредуктазы оказались комплексы 5 и 6 на основе амидов бексаротина. При этом активность 7 и 8, содержащих фрагмент лонидамина, оказались менее активными, что связано с большей устойчивостью комплексов 5 и 6 по отношению к гидролизу.