Криохимический синтез и свойства кристаллических наноструктур стероидного гормонаНИР

Соисполнители НИР

ФГБНУ "МГНЦ" Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Криохимический синтез и свойства кристаллических наноструктур стероидного гормона
Результаты этапа: В работе криохимическими методами синтезированы наночастицы 3-бета-гидрокси-андрост-5-ен-17-она (ДГЕА). Основные результаты в отчетном году получены динамическим методом, который основан на переводе исходных кристаллов ДГЕА в газовую фазу потоком нагретого инертного газа носителя, сопровождаемым управляемой конденсацией на холодную поверхность образуемых в процессе пересыщения газовой фазы твердых наночастиц ДГЕА. Сравнение исходного ДГЕА и его наночастиц посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрической детекцией, показало, что при криохимическом синтезе наночастиц не происходит изменения молекулярной структуры гормона. Оценка средних размеров частиц по измерению количества адсорбированного аргона хроматографическим методом показало, что в зависимости от экспериментальных условий средние размеры частиц составляли 100-180 нм. Из предварительных измерений с применением атомно-силовой зондовой микроскопии, размер частиц наноформы ДГЕА был определен в 100±10 нм. Обнаружено криоформирование, в виде наноформы с размерами кристаллов 100 – 200 нм, новой полиморфной модификации ДГЕА, обозначенной авторами проекта как FVII. Методом порошкового рентгенофазового анализа (пРФА) определены ее кристаллографические параметры и проведена полная расшифровка ее кристаллической структуры. Параметры элементарной ячейки фазы FVII ДГЕА: пространственная группа P21, a = 13,105(2) Å, b = 5,9034(18) Å, c = 10,829(2)Å, α = 900, β = 97,64(2)0, γ = 900. Особенностью кристаллической модификации FVII ДГЕА, отличающую ее от других полиморфных модификаций, является необычная организация системы водородных связей. В образовании водородных связей участвует только гидроксильная группа молекул ДГЕА. В других полиморфных соединениях наряду с гидроксильной группой, в образовании системы водородных связей участвует и карбонильный атом кислорода. Система водородных связей FVII выстраивает молекул ДГЕА в бесконечную цепочку. Осуществлено изучение влияния на выход новой полиморфной наномодификации ДГЕА FVII изменения температуры испарителя, природы газа носителя и его приведенного мольного потока. Параллельно с анализом новой полиморфной модификации FVII методом пРФА впервые определены кристаллографические параметры известной полиморфной модификации ДГЕА FIII, проведена расшифровка кристаллической структуры. Параметры элементарной ячейки фазы FIII ДГЕА: пространственная группа P21, a = 14,5339(18) Å, b = 10,3792(14) Å, c = 11,8253(14) Å, α = 900, β = 111,559(18)0, γ = 900. По данным работы подготовлена статья в журнал «CrystalGrowthandDesign». В 2015 году поставлена и освоена рекомендованная фармкомитетом методика для быстрой оценки стабильности лекарственных соединений. Сравнение цитотоксичности исследуемых образцов на культуре глиальных клеток линии С6 показало, что модифицированный образец ДГЭА имеет меньшую токсичность. По данным работы подготовлена статья в Химико-фармацевтический журнал.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Криохимический синтез и свойства кристаллических наноструктур стероидного гормона
Результаты этапа: В соответствии с общим и календарным планом работы, усилия участников проекта в 2016 году были направлены на исследование влияния внешних факторов: температур испарителя и конденсора, расстояния между соплом испарителя и конденсором (l), природы газа – носителя и его приведенного мольного потока (S-1*dn/dt), механизма зародышеобразования и роста частиц, на: размеры частиц, фазовое состояние, и выход получаемых при криосинтезе кристаллических полиморфных наноструктур 3-бета-гидрокси-андрост-5-ен-17-она (ДГЕА). Обнаружено, что размеры частиц и фазовое состояние получаемых при криосинтезе кристаллических полиморфных наноструктур ДГЕА мало зависят от параметров l и S-1*dn/dt. Найдено, что твердофазная структура и размеры частиц зависят от температур испарителя и конденсора, природы газа – носителя, механизма зародышеобразования и роста частиц. Показано, что смена газа – носителя с углекислого газа на азот приводит к уменьшению содержания новой фазы FVII до 70 %, практическому исчезновению новой фазы FVIII и росту содержания известной фазы FIII до 30 %. Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве газа – носителя аргона. При применении гелия, соотношение содержания фаз FIII : FVII : FVIII составляло: 60 : 30 : 10. Обнаружено, что использование гелия приводит к получению частиц со средним размером превышающим 300 нм. Найдено, что изменение температуры конденсора с 77 К до 273 К приводило к увеличению средних размеров частиц образцов ДГЕА до микронных размеров, при этом они практически на 100 % состояли из известной фазы FII ДГЕА. Исключение из опыта газа – носителя и проведение процесса в глубоком вакууме, исключающем столкновение молекул ДГЕА на пути от испарителя до холодной поверхности, приводит к коренному изменению фазового состава получаемых образцов ДГЕА – в этих условиях они более чем на 85 % состоят из известной фазы ДГЕА FII. Отмеченные различия обусловлены сменой механизма зародышеобразования и роста частиц с гомогенного газофазного на гетерогенный поверхностный. Смена механизма криохимического синтеза наночастиц ДГЕА не приводит к значительному изменению средних размеров частиц получаемых образцов. В 2016 году исследована эволюция наноформ ДГЕА под действием жидкой воды, а также ее паров. Для освобождения образцов ДГЕА от жидкой воды использовали низкотемпературную вакуумную сублимацию. Обнаружено, что под действием паров воды при комнатной температуре, в условиях 100 %-ной влажности, наноформа ДГЕА, содержащая изначально 85 % фазы FVII и 15 % фазы FVIII переходит в неизвестный ранее кристаллогидрат ДГЕА состава 1 : 1, названный нами S5. Для полного перехода требуется промежуток времени более пяти дней. Методом порошкового рентгенофазового анализа (пРФА) определены параметры и проведена расшифровка кристаллической структуры кристаллогидрата ДГЕА S5. Параметры элементарной ячейки S5 ДГЕА: кристаллографическая система – орторомбическая, пространственная группа - P212121, a = 22,506(3) A, b = 11,197(2) A, c = 6,8094(18) A, alfa = beta = gamma = 90 град, V = 1716,0(6), Z = 4. Эксперименты начатые с жидкой водой показали, что наноформа ДГЕА, содержащая изначально 85 % фазы FVII и 15 % фазы FVIII в течение нескольких минут переходит в известный кристаллогидрат ДГЕА S2 состава 1 : 1. Средний размер частиц кристаллогидрата S2 ДГЕА растет при увеличении времени контакта с водой в течение трех часов и составляет по данным БЭТ 180 нм. Освобождение наноформ кристаллогидратов ДГЕА от воды, путем выдерживания при комнатной температуре в вакууме в течение суток, приводило к превращению S5 и S2 в известную безводную модификацию ДГЕА FII сопровождаемое укрупнением частиц препарата до микронных размеров. В 2016 году было изучено влияние температуры и условий хранения на стабильность новой полиморфной модификации. Показано, что хранение в течение двух месяцев образцов наноформы ДГЕА FVII в холодильнике при температуре от 0 до минус 5 град С не приводит к изменению структурно – размерных характеристик препарата. Выдерживание аналогичных образцов при температуре +60 град С в течение одних суток приводило к укрупнению частиц до микронных размеров и полному переходу новой фазы FVII в известную фазу FII. В отчетном году произведена наработка партии криохимически модифицированного ДГЕА со средним размером частиц 100 нм с содержанием новой фазы FVII 85 %. Препарат передан на медико – биологические испытания на мышах в центр медицинской генетики РАН. Предварительные данные испытаний показали высокую эффективность препарата, регулярное введение наноформы ДГЕА приводит к значительному увеличению продолжительности жизни старых мышей. В 2016 году была решена задача расчета стационарного теплового поля, возникающего при движении фронта потока газа – носителя от сопла испарителя до холодной поверхности конденсора. Варьируемыми параметрами модели являются: температуры испарителя и конденсора, приведенный мольный поток газа - носителя (S-1*dn/dt), расстояние между соплом испарителя и конденсором (l), теплофизические свойства газа – носителя. Полученные в 2016 году результаты докладывались на Международной конференции «Химия и физика низких температур» (CPLT-2016, Биариц, Франция) и на конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация и материалы нового поколения» (г. Иваново, Россия). Опубликована статья в журнале: «Crystal Grown and Design», 2016, 16, 1088 – 1095
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Криохимический синтез и свойства кристаллических наноструктур стероидного гормона
Результаты этапа: В соответствии с общим и календарным планом при выполнении проекта получены следующие результаты: Осуществлено дальнейшее развитие разработанной авторами комбинированной криохимической стратегии размерной и структурной модификации лекарственных средств на примере стероидного гормона 3-бета-гидрокси-андрост-5-ен-17-она (ДГЕА). Применяемая стратегия основана на сочетании газовой и твердой фаз, высоких и низких температур и проведении опытов по синтезу наночастиц и наноструктур в динамическом и статическом режимах. Применение криохимического синтеза в динамическом режиме для ДГЕА, позволило получить новую полиморфную модификацию FVII, а также новый кристаллогидрат состава 1:1 S5. Кристаллографические структуры FVII и S5 расшифрованы методом порошкового рентгеноструктурного анализа (п-РСА). Одновременно расшифрована кристаллографическая структура, ранее известной полиморфной модификации ДГЕА FIII. Наряду с образованием новой полиморфной модификации FVII, зафиксировано образование еще одной, ранее неизвестной, полиморфной модификации ДГЕА FVIII. Эта модификация проявляется на дифрактограммах в виде четырех уширенных пиков, что не дает возможности для расшифровки ее кристаллической структуры. При выполнении проекта впервые получены результаты по влиянию условий опыта и природы инертных газов – носителей (диоксида углерода, азота и гелия) на физико – химические свойства, размеры частиц и твердофазную структуру ДГЕА. Найдено, что наиболее селективный выход новой наноформы FVII, с размером частиц 10010 нм, имеет место при использовании в качестве инертного газа – носителя диоксида углерода. Для наноформы FVII, осуществлено получение образцов имеющих разные размеры и проведена трансформация в разные структуры одного размера. Начата разработка количественных моделей зародышеобразования, роста и формирования полиморфных наноструктур в условиях динамического режима. Результаты проекта по мнению участников открывают новые возможности для дифференциации влияния размеров и фазового состава структуры на биологические и терапевтические свойства ДГЕА и других лекарственных препаратов. Для получения наночастиц ДГЕА использовали комбинированную криохимическую стратегию, включающую динамический и статический варианты. Основные результаты получены динамическим методом, который основан на сублимации исходных кристаллов ДГЕА со средним размером ~100 мкм в потоке нагретого инертного газа носителя, сопровождаемой направленной конденсацией на поверхности, охлаждаемой жидким азотом (а в некоторых случаях и другими хладоагентами), что обеспечивало зародышеобразование, рост наночастиц и формирование полиморфных структур. Изучение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС), исходного ДГЕА и его наноформы, показало, что при криосинтезе наночастиц не происходит изменения молекулярной структуры ДГЕА. Методом порошкового рентгенофазового анализа (пРФА) и ИК-Фурье спектроскопии, обнаружено образование в виде наноформы, новых полиморфных модификаций ДГЕА, обозначенных авторами проекта как FVII и FVIII (ранее было известно шесть). Установлено, что на выход новой полиморфной модификации ДГЕА FVII, влияют: - температуры сублиматора (в интервале 100 – 140 град С) и конденсора, - природа газа – носителя (в качестве газов - носителей использовали диоксид углерода, азот, гелий), - приведенный мольный поток газа – носителя (в интервале 0,033 – 0,106 моль*м-2*с-1). Показано, что максимальный выход новой полиморфной модификации FVII (более 70 %) достигается при температуре сублиматора 140 град С, температуре конденсора -196 град С, при использовании в качестве газа – носителя диоксида углерода, с приведенным мольным потоком 0,067 моль*м-2*с-1. При этом указанные образцы содержат кроме фазы FVII только фазу FVIII. Размеры частиц в образцах с максимальным содержанием фазы FVII ДГЕА, по данным измерения адсорбированного аргона, в зависимости от экспериментальных условий, изменяется от 90 до 180 нм. Из измерений с применением атомно-силовой зондовой микроскопии, размер частиц наноформы ДГЕА определен как 100 ± 10 нм. Методом пРСА определены кристаллографические параметры новой полиморфной модификации ДГЕА FVII и проведена расшифровка ее кристаллической структуры. Параметры элементарной ячейки фазы FVII ДГЕА: пространственная группа - P21, a = 13,105(2) Å, b = 5,9034(18) Å, c = 10,829(2) Å, alfa = 90 град, beta = 97,64(2) град, gamma = 90 град. Особенностью кристаллической структуры FVII ДГЕА, отличающую ее от других полиморфных модификаций, является необычная организация системы водородных связей. В образовании водородных связей участвует только гидроксильная группа молекул ДГЕА. В других полиморфных модификациях, наряду с гидроксильной группой, в образовании системы водородных связей участвует и карбонильный атом кислорода. Система водородных связей FVII выстраивает молекулы ДГЕА в бесконечную цепочку. Параллельно с анализом новой полиморфной модификации FVII, методом пРСА, впервые определены кристаллографические параметры и проведена расшифровка кристаллической структуры известной полиморфной модификации ДГЕА FIII. Параметры элементарной ячейки фазы FIII ДГЕА: пространственная группа P21, a = 14,5339(18) Å, b = 10,3792(14) Å, c = 11,8253(14) Å, alfa = 90 град, beta = 111,559(18) град, gamma = 90 град. Исследована эволюция наноформ ДГЕА под действием жидкой воды, а также ее паров. Для освобождения образцов от жидкой воды использовали низкотемпературную вакуумную сублимацию. Показано, что под действием паров воды при комнатной температуре, в условиях 100 % влажности, наноформа ДГЕА, содержащая более 70 % фазы FVII (остальное - фаза FVIII), переходит в неизвестный ранее кристаллогидрат ДГЕА состава 1:1, названный нами S5. Для полного перехода требуется более пяти дней. Методом пРСА определены кристаллографические параметры и проведена расшифровка кристаллической структуры кристаллогидрата ДГЕА S5. Параметры элементарной ячейки S5 ДГЕА: кристаллографическая система – орторомбическая, пространственная группа - P212121, a = 22,506(3) Å, b = 11,197(2) Å, c = 6,8094(18) Å, alfa = beta = gamma = 90 град, V = 1716,0(6), Z = 4. По данным работы опубликована статья в журнале «Crystal Growth and Design», 2016, 16, 1088 – 1095. Эксперименты с жидкой водой показали, что наноформа ДГЕА, содержащая более 70 % фазы FVII (остальное фаза FVIII), в течение нескольких минут переходит в известный кристаллогидрат ДГЕА S2 состава 1:1. Средний размер частиц кристаллогидрата S2 ДГЕА растет при увеличении времени контакта с водой и при выдерживании в течение трех часов, он составляет 180 нм. Освобождение наноформ кристаллогидратов ДГЕА от воды, путем выдерживания в вакууме при комнатной температуре в течение суток, приводило к превращению S5 и S2 в известную безводную модификацию ДГЕА FII и укрупнению частиц до микронных размеров. Освоена рекомендованная фармакомитетом методика быстрой оценки стабильности лекарственных соединений. Изучено влияние температуры и условий хранения на стабильность новой полиморфной модификации. Показано, что хранение в течение двух месяцев образцов наноформы FVII, в холодильнике при температуре от 0 град С до -5 град С не приводит к изменению структурно – размерных характеристик. Выдерживание аналогичных образцов при температуре +60 град С в течение одних суток приводило к укрупнению частиц до микронных размеров и полному переходу новых фаз FVII и FVIII в известную фазу FII. Установлено, что размеры частиц и фазовое состояние получаемых при криосинтезе кристаллических полиморфных наноструктур ДГЕА мало зависят от температуры сублиматора и приведенного мольного потока газа - носителя. Найдено, что наибольшее влияние на твердофазную структуру и размеры частиц, оказывают температура конденсора, и природа газа – носителя, которые определяют механизмы зародышеобразования и роста частиц. При исследовании влияния природы инертных газов-носителей установлено ранее неизвестное явление. Максимальный выход новой полиморфной модификации FVII ДГЕА, имеет место при использовании в качестве газа-носителя диоксида углерода. Замена его на азот и гелий приводит к уменьшению выхода FVII и появлению других полиморфов ДГЕА. При замене диоксида углерода на гелий, основной фазой является известная фаза FIII, которая практически отсутствует в случае диоксида углерода. При этом соотношение содержания фаз FIII : FVII : FVIII составляло: 60% : 30% : 10%, соответственно. Размер частиц составляет 300 нм. Все эксперименты с различными газами-носителями проводились в сопоставимых условиях. Найдено, что изменение температуры конденсора с – 196 град С до – 78 град С, при сохранении остальных параметров эксперимента (газ – носитель – СО2, температура сублиматора 140 град С, приведенный мольный поток - 0,067 моль*м-2*с-1), не приводило к изменению фазового состава образцов ДГЕА, но, увеличило размер наночастиц со 10010 нм до 350 40 нм. Отмеченный факт положен в основу получения образцов имеющих одну структуру с разными размерами и будет использован при работе с глиальными клетками. Статический режим основан на сублимации исходных кристаллов ДГЕА со средним размером ~100 мкм в условиях высокого вакуума и свободном движении молекул соединения от нагретого сублиматора до охлаждаемой жидким азотом или другим хладоагентом поверхности. Проведение опытов в отсутствии газа – носителя в глубоком вакууме, исключало столкновение молекул ДГЕА на пути от сублиматора до холодной поверхности и приводило к коренному изменению фазового состава образцов ДГЕА. В зависимости от природы поверхности и температуры конденсора, состав образцов может отличаться. При осаждении на медную поверхность, преобладающей фазой является форма FIII (более 80 %), дополнительно, такие образцы содержат форму FII и следы формы FVII. При осаждении на стеклянную поверхность, в ходе того же эксперимента, преобладающей фазой является форма FII (более 70 %), дополнительно, образцы содержат форму FIII. Таким образом, в отсутствии газа - носителя новые фазы FVII и FVIII в образцах практически отсутствуют. Различия фазового состава в динамическом и статическом варианте обусловлены влиянием инертного газа-носителя. Наличие газа-носителя, его природа и взаимодействие при соударениях с молекулами ДГЕА определяет энергетику молекул, которые на холодной поверхности формируют получаемые полиморфные наноформы в динамическом режиме. При этом средний размер частиц получаемых образцов, при наличии газа-носителя и в его отсутствии лежит в пределах от 10010 нм до 22025 нм. Размер частиц и их стабильность определяются температурой конденсора. При выполнении проекта разработана методика получения образцов имеющих разный фазовый состав при одном размере. Синтез подобных образцов осуществляли контролируемым отжигом. Например, образцы ДГЕА, содержащие более 80 % формы FIII (остальное – форма FII и следы формы FVII), со средним размером частиц 36040 нм были синтезированы из образцов со средним размером частиц 10010 нм, содержащих более 70 % фазы FVII (остальное фаза FVIII) путем выдерживания при температуре 120 град С в течении 20 мин. Полученные результаты криохимического синтеза по исследованию влияния экспериментальных факторов на фазовый состав и размеры частиц, при разных температурах конденсора в сочетании с контролируемой трансформацией образцов, позволяют решить проблему одновременного управления фазовым составом и размерами частиц ДГЕА. Подобная постановка задачи и ее решение не имеет аналогов в мировой литературе. Результаты проекта, позволяют подойти к решению фундаментальной проблемы разделения эффектов влияния твердофазной структуры и размера частиц для нейрогормона ДГЕА и других лекарственных веществ. Результаты, полученные динамическим и статическим методом приведены в статье, опубликованной в журнале «Molecules”, 2017, 22(8), 1378. При реализации проекта были решены задачи для модельного описания процессов зародышеобразования и роста частиц в потоке газа – носителя. Решена задача расчета стационарного теплового поля, возникающего при движении фронта потока газа – носителя от сопла испарителя до холодной поверхности конденсора. Варьируемыми параметрами модели являются: температуры испарителя и конденсора, приведенный мольный поток газа - носителя (S-1*dn/dt), расстояние между соплом испарителя и конденсором, теплофизические свойства газа – носителя. Рассмотрены подходы к расчету скорости зародышеобразования и роста частиц в стационарном тепловом поле, возникающем при движении фронта потока газа – носителя от сопла испарителя до холодной поверхности конденсора. Начато сравнение цитотоксичности исследуемых образцов на культуре глиальных клеток линии С6. Предварительные результаты работы показали, что новые модификации ДГЭА не имеют существенных отличий. Полученные результаты опубликованы в журнале «Химико – фармацевтическом журнале» 2015, 49(12), 15-18. Произведена наработка партии криохимически модифицированного ДГЕА со средним размером частиц 10010 нм содержащих более 70 % фазы FVII (остальное фаза FVIII). Препарат передан на медико – биологические испытания на мышах в центр медицинской генетики РАН. Предварительные опыты показали, что введение новой наноформы ДГЕА приводит к увеличению жизни старых мышей. Результаты проекта докладывались на XXII Международной конференции по органическим реакциям в твердых телах ICCOSS-2015 (Ниигата, Япония), Международной конференции по химии и физике низких температур CPLT-2016 (Биариц, Франция), IX Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация и материалы нового поколения» (г. Иваново, Россия) – 2016, XXIII Международной конференции по органическим реакциям в твердых телах ICCOSS-2017 (Стелленбош, ЮАР).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".