![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
В рамках проекта разработан метод химической модификации остатков аргинина в составе белков и продемонстрирована эффективность этого метода на примере модельных пептидов и ряда белков. Показано, что алифатические 1,3-дикетоны малореакционноспособны в условиях, оптимальных для функционирования белков. Предложен и осуществлен синтез 1,3-дикетона с электронакцепторной фенильной группой, позволяющей увеличить реакционную способность по отношению к остаткам аргинина в составе белков. Для этого были впервые синтезированы производные биотина, дестиобиотина и родамина 6Ж, содержащие 1,3-дикетогруппу. На модельных пептидах было продемонстрировано, что предложенные реагенты взаимодействуют как с остатками аргинина, так и с остатками лизина и N-концевой аминогруппой. Однако в последних двух случаях продукт присоединения стабилен только после восстановления цианоборгидридом натрия. Если же после проведения реакции дополнительно добавить раствор гидроксиламин при рН 5, то происходит разрушение оснований Шиффа и возможна идентификация только продуктов селективного присоединения к остаткам аргинина. Использование 1,3-дикетопроизводного флуоресцентного красителя родамина 6Ж позволило отработать условия присоединения к различным белкам в довольно широком диапазоне pH - от 7.5 до 9.0. Используя отработанные условия, были получены образцы интеграз пенообразующего вируса человека и ВИЧ-1, обработанные бета- дикетоновым производным биотина, а также цианоборогидридом натрия или гидроксиламином. Затем был проведен МАЛДИ масс- спектрометрический анализ данных образцов с детекцией высоких масс. Однако из-за низкой ионизационной способности полноразмерных интеграз нам не удалось достоверно идентифицировать продукты их взаимодействия с 1,3-дикетоном. Было решено провести аффинную хроматографию на стрептавидин-сефарозе прореагировавших с производным дестиобиотина пептидов интеграз, получившихся в результате протеолитического расщепления. Для этого были оптимизированы условия протеолитического расщепления обеих интеграз трипсином и последующего масс-спектрометрического анализа полученных пептидов. На момент написания данного отчета масс- спектрометрический анализ образов в связи со сложностью проводимых исследований и недостатком времени осуществить не удалось.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 3 августа 2012 г.-31 декабря 2012 г. | Изучение структуры НК-белковых комплексов с помощью химической модификации остатков аргинина |
Результаты этапа: Показано, что алифатические 1,3-дикетоны малореакционноспособны в условиях, оптимальных для функционирования белков. Предложен и осуществлен синтез 1,3-дикетона с электронакцепторной фенильной группой, позволяющей увеличить реакционную способность по отношению к остаткам аргинина в составе белков. Оптимизированы условия трипсинолиза интегразы пенного вируса человека и анализа триптических пептидов методом MALDI масс-спектрометрии. | ||
2 | 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. | Изучение структуры НК-белковых комплексов с помощью химической модификации остатков аргинина |
Результаты этапа: В рамках проекта разработан метод химической модификации остатков аргинина в составе белков и продемонстрирована эффективность этого метода на примере модельных пептидов и ряда белков. Показано, что алифатические 1,3-дикетоны малореакционноспособны в условиях, оптимальных для функционирования белков. Предложен и осуществлен синтез 1,3-дикетона с электронакцепторной фенильной группой, позволяющей увеличить реакционную способность по отношению к остаткам аргинина в составе белков. Для этого были впервые синтезированы производные биотина, дестиобиотина и родамина 6Ж, содержащие 1,3-дикетогруппу. На модельных пептидах было продемонстрировано, что предложенные реагенты взаимодействуют как с остатками аргинина, так и с остатками лизина и N-концевой аминогруппой. Однако в последних двух случаях продукт присоединения стабилен только после восстановления цианоборгидридом натрия. Если же после проведения реакции дополнительно добавить раствор гидроксиламин при рН 5, то происходит разрушение оснований Шиффа и возможна идентификация только продуктов селективного присоединения к остаткам аргинина. Использование 1,3-дикетопроизводного флуоресцентного красителя родамина 6Ж позволило отработать условия присоединения к различным белкам в довольно широком диапазоне pH - от 7.5 до 9.0. Используя отработанные условия, были получены образцы интеграз пенообразующего вируса человека и ВИЧ-1, обработанные бета- дикетоновым производным биотина, а также цианоборогидридом натрия или гидроксиламином. Затем был проведен МАЛДИ масс- спектрометрический анализ данных образцов с детекцией высоких масс. Однако из-за низкой ионизационной способности полноразмерных интеграз нам не удалось достоверно идентифицировать продукты их взаимодействия с 1,3-дикетоном. Было решено провести аффинную хроматографию на стрептавидин-сефарозе прореагировавших с производным дестиобиотина пептидов интеграз, получившихся в результате протеолитического расщепления. Для этого были оптимизированы условия протеолитического расщепления обеих интеграз трипсином и последующего масс-спектрометрического анализа полученных пептидов. На момент написания данного отчета масс- спектрометрический анализ образов в связи со сложностью проводимых исследований и недостатком времени осуществить не удалось. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".