ИСТИНА

Проект направлен на осуществление функциональных исследований системы репарации неканонических пар, «мисматчей». Система репарации мисматчей (ММR) узнаёт и восстанавливает правильность структуры ДНК после возникновения ошибок ДНК-полимеразы. Главные компоненты системы репарации MMR в случае прокариот (а в наших экспериментах - E. coli) являются гомодимерные АТФазы: MutS и MutL, а также третий белок – мономерная эндонуклеаза MutH, являются объектами данного исследования. Ключевой белок системы репарации MMR, MutS, взаимодействует с ДНК, обнаруживает мисматч и затем в присутствии АТФ образует комплекс с белком MutL («тройной» комплекс). В данной работе удалось зафиксировать на реакционноспособных ДНК как сканирующий комплекс, так и специфический комплекс MutS с мисматчем. Этот комплекс (состоящий из ДНК–MutS–MutL) является промежуточным активным участником, соединяющим процесс узнавания мисматча и дискриминацию матричной (правильной) и дочерней (ошибочной) цепей ДНК.

Наши результаты по белок-белковым пришивкам свидетельствуют о том, что нам удалось зафиксировать «тройной» комплекс. Применены три способа ковалентной фиксации белка MutS на реакционноспособных ДНК. В этих подходах использовались ДНК с 2'-йодацетамидной или 2'-пиридилдисульфидной группировками, а также олигонуклеотиды с 3?-концевой дитиогруппой RSS(CH2)3- (где R=(CH2)3O-), и MutS, содержащие единственный остаток цистеина на молекулу. Рекомбинантные белки scMutS(A469C/дельта801-853) и scMutS(N497C/дельта801-853) были получены с использованием бактериальных рекомбинантных систем для их экспрессии. Все модификации кроме 2'-йодацетамидной (до 10% от комплекса) обеспечивали высокий выход конъюгата (до 90%). Были разработаны эффективные протоколы для очистки конъюгатов, основанные на гель-фильтрации или на аффинной хроматографии с носителем гепарин-сефарозой. Созданы флуоресцентные ДНК-системы, позволяющие наблюдать переход белка MutS в конформацию «сканирующий зажим». Были предложены новые модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие малеимидную группировку, присоединенную к 5-ому положению гетероциклического основания дезоксиуридина с помощью линкеров различной длины и конформационной подвижности. Были синтезированы олигонуклеотиды-предшественники с концевой этинильной группой, присоединенной к 5-ому положению урацила с помощью линкеров различной структуры. Осуществлён детальный анализ тимидингликоля в составе ДНК (Tg, (5R, 6S)-стериоизомера) в составе пар G/Tg и A/Tg как объекта репарации системы MMR. Процесс репарации MMR воспроизведен in vitro в присутствии кольцевых ДНК, содержащих Tg. Активации эксцизионной репарации не наблюдалось. Дополнительно были проведенны. флуоресцентные эксперименты, исследование сродства белка MutS к тимидингликольсодержащим ДНК, эксперименты по обмену нуклеотидов и гидролизу АТФ. Результаты этих экспериментов позволяют сделать вывод, что тимидингликоль скорее всего не репараируется системой MMR.