ИСТИНА

Проект направлен на исследование взаимодействий двух ферментов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1), интегразы (ИН) и обратной транскриптазы (ОТ). Известно, что ИН ВИЧ-1 помимо своей основной функции – встраивания ДНК копии вирусного генома в геном зараженной клетки – оказывает влияние и на ряд других этапов репликации вируса, в частности, на этап обратной транскрипции. Показано, что некоторые аминокислотные замены в ИН блокируют процесс обратной транскрипции в зараженных клетках. Однако до настоящего времени не выяснено, как конкретно взаимодействует эти два фермента, и данные об их взаимном влиянии на каталитическую активность достаточно противоречивы. В рамках настоящего проекта предполагается выяснить, каким образом ИН взаимодействует с ОТ, и уточнить, на какую из каталитических активностей ОТ влияет ИН. Предполагается также провести поиск ингибиторов взаимодействия ИН с ОТ, поскольку соединения, способные подавлять это взаимодействие, могут оказаться новыми ингибиторами репликации вируса.

Основная задача, которая была поставлена перед нами в рамках настоящего проекта, состояла в изучении двух ферментов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1): интегразы (ИН) и обратной транскриптазы (ОТ). В первую очередь, на данном этапе выполнения работ, мы решили изучить непосредственное взаимодействие этих двух ферментов флуоресцентными методами. Для этого ИН и ОТ были помечены малеимидом флуоресцеина и N-гидроксисукцинимида Alexa 350, соответственно. При этом необходимо отметить, что в случае ИН ВИЧ-1 нам пришлось проводить введение красителя на стадии выделения белка до добавления восстановителя дитиотереитола (ДТТ), так как малеимидная группировка не может эффективно взаимодействовать с остатками цистеина белка в присутствии большого избытка тиольных групп восстановителя. Использовать N-гидроксисукцинимидное производное флуоресцеина мы также не могли из-за необходимости проведения реакции при значениях pH выше 8.5, при которых ИН полностью и необратимо теряет свою активность. В результате этой вынужденной модификации методики выделения ИН не только значительно увеличилась трудоемкость этого процесса, но и выходы рекомбинантного белка резко снизились. Тем не менее, мы провели связывание меченных белков друг с другом в буфере, состав которого был подобран на первом этапе выполнения данного проекта и позволял обоим ферментам сохранять в нем свою активность. Оказалось, что при возбуждении длиной волны 346 нм происходит возбуждение не только красителя Alexa 350, но и самого флуоресцеина, хотя его максимум поглощения находится в области 488 нм. Таким образом, наблюдалось возбуждение флуоресценции флуоресцеина не только в результате переноса энергии на него с красителя Alexa 350, но и за счет поглощаемого света источника. Данный факт значительно затрудняет достоверную интерпретацию полученных данных. После этого, было принято решение заменить пару флуоресцентных красителей между которыми должен происходить перенос энергии. Для того, чтобы не повторять выделение меченной ИН, была выбрана пара флуоресцеин/тетраметилродамин, причем N-гидроксисукцинимид тетраметил родамина использовался для мечения ОТ. К сожалению, при совместной инкубации белков не наблюдалось резонансного переноса энергии между красителями. По всей видимости, это может объясняться двумя причинами: либо присоединенные к белкам флуоресцентные группировки расположены настолько далеко друг от друга, что между ними невозможен перенос энергии, либо, что в условиях эксперимента данные белки не формируют достаточно устойчивого компекса. Таким образом, нам не удалось данным методом изучить взаимодействие ферментов, поэтому мы перешли к изучению их взаимного влияния. На первом этапе проекта было изучено влияние диких типов данных белков на каталитические активности друг друга. На данном этапе мы решили выяснить, как отразятся определенные аминокислотные замены ИН на их взаимное влияние. Известно, что за связывание с ОТ ответственны аминокислотные остатки С-концевого домена ИН [Wilkinson T.A., et al. J. Biol. Chem. 2009. 284 (12): 7931-7939; Lu R., et al. J. Virol. 2005. 79 (16): 10356-10368; Tsurutani N., et al. J. Virol. 2000. 74: 4795-4806]. Для выполнения данной работы были выбраны аминокисотные замены ИН: замены V250E и K258A, которые влияют на обратную транскрипцию на уровне вируса [Wilkinson T.A., et al. J. Biol. Chem. 2009. 284 (12): 7931-7939; Lu R., et al. J. Virol. 2005. 79 (16): 10356-10368], замена R228A, которая влияет на связывание ИН с ОТ [Krishnan L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. 107 (36): 15010-15915; Zhao Z., et al. J. Biol. Chem. 2008. 283(9): 5632-5641], а также некоторые другие замены в С-концевом домене ИН, а именно, R228A, D229A, R231A, D232A, K236A, которые также могут оказывать влияние на взаимодействие ИН с ОТ, поскольку они находятся в С-концевом домене ИН и расположены в пространстве вблизи остатков R228, V250 и K258. Прежде чем приступать к изучению влияния мутантных препаратов ИН на активность ОТ, необходимо было убедиться в том, что введенные в ИН мутации не привели к инактивации белка. Это важно, т.к. изучение влияния ферментов друг на друга возможно лишь при достаточной активности ОТ и ИН. Для этого требовалось проверить активность новых мутантов при связывании с ДНК-субстратом, а также в реакции 3’-процессинга. Было показано, что замены R228А, V250E и K258A уменьшают ДНК-связывающую активность ИН, причем в случае замен R228А и K258A это уменьшение связано с нарушением структуры С-концевого домена, отвечающего за связывание ДНК. Кроме того, было установлено, что все введенные аминокислотные замены, кроме D232A, уменьшают каталитическую активность ИН в реакции 3’-концевого процессинга, а замена D232A увеличивает ее. На основании полученных результатов было принято решение о возможности дальнейшего изучения влияния всех введенных мутаций на активность ИН и ОТ. В первую очередь, было изучено влияние ОТ на активность ИН и ее мутантных препаратов в реакции 3’-процессинга. Оказалось, что активность ИН и мутантного препарата с заменой в 228 положении снижается на 50% уже при концентрации ОТ порядка 4 нМ, т.е. в 25 раз меньше концентрации самой ИН. Очевидно, что между ИН и ОТ возникают белок-белковые взаимодействия, инактивирующие ИН. Для других мутантных препаратов ИН 50%-ное снижение активности наблюдается при более высоких концентрациях ОТ (9-19 нМ). Вероятно, это свидетельствует о том, что при введении данных мутаций нарушаются контакты между ИН и ОТ. Затем мы перешли к оценке влияния ИН и ее мутантных форм на активность ОТ. На предыдущем этапе было установлено, что ИН не оказывает значительного влияния на активность ОТ в РНКазной реакции, поэтому изучение влияния аминокислотных замен ИН на этот процесс было решено не проводить. Был проведен анализ влиянии ИН и её мутантных препаратов на ДНК-зависимую ДНК-полимеразную активность ОТ. Было установлено, что добавление ИН дикого типа приводит к стимуляции этой реакции и увеличивает активность ОТ почти в два раза. Мутантные препараты ИН также оказывали стимулирующее действие, причем степень влияния ИН на ДНК-полимеразную активность ОТ обратно пропорциональна активности данного препарата ИН.