Исследование взаимодействий интегразы и обратной транскриптазы ВИЧ-1НИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. Исследование взаимодействий интегразы и обратной транскриптазы ВИЧ-1
Результаты этапа: За первый год выполнения проекта были получены препараты ИН, содержащие мутации K258A, W243E и V250E, которые подавляют обратную транскрипцию в инфицированных ВИЧ-1 клетках. Подобраны условия проведения ферментативных реакций, в которых оба фермента, ОТ и ИН, проявляют каталитическую активность, сравнимую с их активностью в стандартных для них условиях. Эта работа оказалось необходима, поскольку в опубликованных условиях для одновремененной работы обоих ферментов выделенные нами белки оказались неактивны. Изучено влияние ИН на полимеразную и РНКазную активности ОТ. Установлено, что ИН при более чем 10-ти кратных молярных избытках по отношению к ОТ снижает РНКазную активность последней на 25 %, что по все видимости вызвано конкуренцией за связывание субстрата. Влияния ИН на полимеразную активность ОТ в подобранных нами условиях не обнаружено. Также исследовано влияние ОТ на каталитическую активность ИН и показано, что ОТ снижает эффективноcть 3’-процессинга; причем, 50%-ное снижение эффективности реакции наблюдается уже при молярном соотношении ОТ и ИН 1:2. Также в проекте продолжено изучение влияния коротких модифицированных олигонуклеотидов на репликацию ВИЧ-1 в культуре клеток. Впервые показано, что 2’-О-метилированный олигонуклеотид GGUUUUUGUGU в комплексе с трансмембранным пептидом эффективно подавляет репродукцию ВИЧ-1 в клеточной системе, причем ингибирование происходит на стадии обратной транскрипции. Получен штамм вируса, частично устойчивый к ингибитору, и показано, что он содержит мутации L100I и K103N в гене ОТ, также характерные для штаммов, устойчивых к ненуклеозидным ингибиторам ОТ. Для выяснения механизма ингибирования репликации ВИЧ-1 изучено влияние олигонуклеотидных ингибиторов на полимеразную и РНКазную активности ОТ. Показано, что олигонуклеотид, содержащий в своей структуре остаток эозина, способен подавлять РНКазную активность ОТ с IC50 = 250 нМ, а РНК-зависимую и ДНК-зависимую ДНК-полимеразные активности с IC50 = 1 мкМ. Олигонуклеотид, не содержащий эозина, подавлял РНКазную активность ОТ значительно менее эффективно, с IC50 = 20 мкМ, а обе полимеразные активности не подавлялись даже 100 мкМ концентрацией этого ингибитора. Ранее было показано, что присутствие эозина существенно повышает способность этого олигонуклеотида ингибировать ИН ВИЧ-1.
2 1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. Исследование взаимодействий интегразы и обратной транскриптазы ВИЧ-1
Результаты этапа: За отчетный период были получены препараты ИН, содержащие мутации R228A, D229A, R231A, D232A, K236A в С-концевом домене, но не в районе 242-258, для которого показано, что он важен для взаимодействия ИН с ОТ, и препарат ИН с мутацией C130S в каталитическом домене. Проведена характеристика ДНК-связывающей и каталитической активности всех мутантных форм ИН, для чего разработан новый метод, основанный на изменении флуоресценции ДНК-субстрата ИН, содержащего флуоресцеин на 3’-конце процессируемой цепи. С его помощью установлено, что замена W243E практически полностью ингибирует активность ИН за счет нарушения структуры С-концевого домена, отвечающего за связывание ДНК. Каталитическая активность ИН также существенно падает при заменах R228A и K258A, замены D229A, D232A и K236A уменьшают эффективность фермента вдвое, а замена D231A увеличивает ее в 1.5 раза. Исследовано влияние всех полученных мутантов ИН на РНКазную и РНК-зависимую ДНК-полимеразную активности ОТ. Достоверного влияния на эффективность гидролиза РНК/ДНК субстрата ОТ не обнаружено ни для одного препарата ИН. В случае РНК-зависимого синтеза ДНК обнаружено незначительное ингибирующее действие всех препаратов ИН кроме мутантов R228A, W243E, V250E и K258A. Также в проекте продолжено изучение механизма ингибирования репликации ВИЧ-1 короткими модифицированными олигонуклеотидами. Впервые установлено, что олигонуклеотидные ингибиторы значительно подавляют шаперонную активность нуклеокапсидного белка ВИЧ-1, и на основании этих данных выдвинуто предположение, что подавление репликации ВИЧ-1 в культуре клеток происходит за счет ингибирования ранних стадий обратной транскрипции, в которых участвует нуклеокапсидный белок.
3 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Исследование взаимодействий интегразы и обратной транскриптазы ВИЧ-1
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта были получены препараты ИН, содержащие мутации С-концевом (R228A, D229A, R231A, D232A, K236A, W243E, V250Е, K258A) и каталитическом (C130S) доменах. Проведена характеристика ДНК-связывающей и каталитической активности всех мутантных форм ИН, для чего разработан новый метод, основанный на изменении флуоресценции ДНК-субстрата ИН, содержащего флуоресцеин на 3’-конце процессируемой цепи. С его помощью установлено, что замена W243E практически полностью ингибирует активность ИН за счет нарушения структуры С-концевого домена, отвечающего за связывание ДНК. Впервые обнаружена мутация в гене ИН, R231A, которая улучшает как связывание ИН с ДНК, так и ее каталитическую активность. При изучении связывания ИН с ОТ обнаружено, что ИН(R231A) связывается с ОТ в 2 раза лучше ИН дикого типа, мутации D229A, D232A и V250E серьезно не влияют на связывание, замены R228A, K236A, W243E и K258A ухудшают связывание ИН с ОТна 50-75%. Показано, что ОТ подавляет активность ИН и всех ее каталитически активных мутантов: эффективность и 3’-процессинга, и переноса цепи снижалась на 50% при молярном соотношении ОТ : ИН = 1:2. Исследовано влияние всех полученных мутантов ИН на РНКазную и полимеразную активности ОТ. Влияние на активность РНКазы Н и ДНК-зависимую ДНК-полимеразную активности ОТ обнаружено только для препарата ИН, содержащего мутацию C130S: увеличивается содержание более длинных продуктов гидролиза РНК и детектируется снижение эффективности синтеза ДНК при увеличении концентрации ИН(C130S). При изучении РНК-зависимого синтеза ДНК обратной транскриптазой обнаружено, что ИН дикого типа и мутанты C130S и R231A снижают эффективность реакции. В случае мутантов R228A, W243E, V250E и K258A никакого эффекта обнаружено не было. Также в проекте планировалось провести поиск ингибиторов взаимодействия ИН с ОТ, при этом основное внимание уделялось модифицированным олигонуклеотидам, которые взаимодействуют с С-концевым доменом ИН и эффективно подавляют ее активность. Показано, что эти соединения не влияют на связывание ИН с ОТ, но, тем не менее, эффективно ингибируют обратную транскрипцию ВИЧ-1 в культуре клеток. Впервые установлено, что олигонуклеотидные ингибиторы значительно подавляют шаперонную активность нуклеокапсидного белка ВИЧ-1, и на основании этих данных выдвинуто предположение, что подавление репликации ВИЧ-1 в культуре клеток происходит за счет ингибирования ранних стадий обратной транскрипции, в которых участвует нуклеокапсидный белок.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".