ИСТИНА

Мобильные элементы составляют значительную долю генома всех изученных к настоящему времени организмов. Транспозиции мобильных элементов могут играть огромную роль в функционировании отдельных генов и всего генетического аппарата в целом, однако сам генетический механизм перемещения мобильных элементов и конкретные гены, задействованные в этом процессе, до сих пор мало изучены. Исследование интегразной активности мобильного элемента МДГ4 у линий дрозофил с генетической нестабильностью позволит понять механизмы встраивания в геном и точного вырезания ретротранспозона. Возможно, что система генетического контроля транспозиций этого элемента может быть сходной с ретротранспозанами семейства Alu, наиболее многочисленным классом мобильных элементов в геноме человека. Понимание механизмов транспозиций Alu элементов поможет определить влияние этих элементов на проявление интеллектуальных способностей у человека.

В настоящее время широко распространены исследования так называемых мобильных генетических элементов, которые способны свободно перемещаться по геному и могут встраиваться в любой его участок. Alu-элементы – семейство коротких тандемных повторов (SINE), перемежающихся с уникальными последовательностями. Среди мобильных элементов человека оно наиболее многочисленно. Его доля составляет 3-5% от всего генома (Chbel, de Pancorbo, Mortinez-Bouzas et. al., 2003). В настоящее время активно ведется поиск Alu-элементов, которые могут влиять на формирование каких-либо сложных признаков человека. Считается, что инсерция мобильного элемента в функционально значимые районы гена (промоторы, терминаторы и т.д.) оказывает существенное влияние на проявление изучаемого признака, что связано с прямым нарушением структуры гена. Инсерции мобильных элементов в некодирующие области (спейсеры, интроны, фланговые участки др.) приводят к более "мягким" последствиям: усилению или ослаблению активности близлежащих генов, а также изменению их регуляции (Deinenger, Batzer, 1999). В ходе исследования изучено 8 Alu-элементов, 6 из которых расположены в кодирующих областях генома человека: в гене калиевого канала KCNJ6, в гене АТФ-связывающего кассетного транспортера ABCA6, в гене ангиотензин-превращающего фермента ACE, в гене микросомальной эпоксидгидролазы EPHX1, в гене протромбина F2 и в гене-супрессоре раковой опухоли р53, и два Alu-элемента семейства Ya5, расположенные в нетранслируемых областях генома (Ya5NBC361 и Ya5NBC203). Общая выборка, проанализированная в данном проекте за отчетный период, составила 1195 индивидов, среди которых были профессиональные спортсмены (кандидаты и мастера спорта), люди, профессионально не занимающиеся спортом и люди с онкологическими заболеваниями. АТФ-связывающий кассетный транспортер ABCA6 задействован в поддержании липидного гомеостаза, предотвращении формирования тучных клеток путем индукции переноса холестерина от макрофагов, а также влияет на способность макрофагов к экзоцитозу. Помимо прочего, макрофаги поглощают ЛПВП, которые осуществляют транспорт холестерина от периферических тканей в печень (Pennings et al, 2006). Alu-элемент Ya5_435, инсерцируется в 25 интрон гена кассетного транспортера ABCA6, интегрального белка, расположенного на поверхности макрофагов. Для изучения биохимического статуса у 236 индивидуумов были изучены показатели липидного профиля сыворотки крови (общего холестерина (ОХС), триглицеринов (ТГ), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП)), а также иммунологический статус (уровень воспаления был оценен по маркеру воспаления – интерлейкину I). Статическая обработка полученных данных проводилась с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и корелляционного анализа при помощи специализированных программ (Statistica 6.1 и SPSS v.14). Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей в группах с низкими и высокими показателями ОХС, ТГ, ЛПНП не выявил достоверных различий. По уровню ЛПВП в сыворотке крови вся выборка была разделена на 3 группы: низкие, нормальные и высокие значения уровня ЛПВП (ниже 0.9 ммоль/литр – низкий, 0.9-1.8 ммоль/литр - нормальный, выше - высокий). При проведении дисперсионного анализа было показано, что при генотипе ABCA6*I*I уровень ЛПВП достоверно ниже, чем у лиц, не являющихся его носителями (F=4.208, ?=0.041). При исследовании влияния генотипа ABCA6*I*D на показатели липидного профиля, было установлено, что уровень ЛПВП при данном генотипе достоверно выше, чем у лиц, не обладающих этим генотипом (F=4.765, ?=0.03). При рассмотрении влияния аллеля ABCA6*D на метаболизм липидов, было обнаружено, что у лиц-носителей данного аллеля уровень ЛПВП достоверно выше (F=4.208, ?=0.041). Полученные данные показывают, что носительство аллеля ABCA6*D ведет к некоторому увеличению уровня ЛПВП, что в свою очередь уменьшает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и вероятность образования атеросклеротических отложений на стенках сосудов. Было показано, что среди лиц с показателями ЛПВП в пределах нормы генотип ABCA6*I/*I встречается достоверно реже (p=0.0172;OR=2.3202;95%CI=1.155-4.074). Таким образом, Alu-элемент Ya5_435 в гене АТФ-связывающего кассетного транспортера ABCA6 способен оказывать определенное влияние на метаболизм ЛПВП в организме человека а также на риск развития заболеваний сердечнососудистой системы. Была изучена встречаемость инсерции этого Alu-элемента у профессиональных спортсменов (кандидатов и мастеров спорта) и людей с низким уровнем общей физической работоспособности. Было показано, что частота встречаемости генотипа ABCA6*I/*I у профессиональных спортсменов достоверно ниже, чем у людей, с низким уровнем ОФР (p=0.006; OR=0.392; 95%CI=0.181-0.785), также как и частота гетерозиготных носителей ABCA6*I/*D (p=0.0009; OR=0.544; 95%CI=0.387-0.759). В то же время генотип ABCA6*D/*D встречался достоверно чаще у профессиональных спортсменов (p=0.005; OR=2.495; 95%CI=0.801-1.403), как и аллель ABCA6*D (p=0.005; OR=0.874; 95%CI=0.801-1.403), а аллель ABCA6*I достоверно реже (p=0.005; OR=1.1442; 95%CI=1.094-1.189). Вероятно, это связано с тем, что инсерция Alu-элемента способна изменять пространственную конформацию кассетного транспортера ABCA6. При статистическом анализе данных, полученных в ходе молекулярно-генетического исследования вставки Alu-элемента в гене калиевого канала KCNJ6 показано, что генотип *I/*I встречается в исследованной выборке с частотой 0,92, а частота генотипа *I/*D составляет 0,07. Частота генотипа * D /*D составила 0,01. Последующее разделение исследуемой выборки на группы, связанные с физиологическими параметрами (профессиональные спортсмены, люди с низким уровнем ОФР, онкобольные) и их последующий анализ, достоверных различий не показал. Для генов микросомальной эпоксидгидролазы EPHX1, протромбина F2 и гена-супрессора раковых опухолей P53 был проведен поиск Alu-элементов, входящих в их структуру, с использованием программы RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org). Для изучения были выбраны Alu-элементы, относящиеся к подсемейству AluY, наиболее молодому из всех подсемейств Alu. Для EPHX1 был изучен Alu-элемент, находящийся в 1 интроне гена. У всех изучаемых индивидуумов был выявлен один генотип *I/*I . Для F2 был изучен Alu-элемент, находящийся в 12 интроне гена. Изучаемые индивидуумы также показали единообразие генотипа: *I/*I. Установлена взаимосвязь между вставкой Alu-элементов и показателями интеллектуального развития. Показано, что высокий уровень интеллектуального развития ассоциирован с генотипом АСЕ*D/*D (Р=0.044; OR=2.223; 95%CI 1.219-3.098), аллелями АСЕ*D (Р=0.031; OR=2.641; 95%CI 1.219-7.074) и Ya5NBC361*D (Р=0.048; OR=1.201; 95%CI 1.002-1.408), не имеющим вставки мобильного элемента. Результаты данного исследования показали, что высокий уровень интеллектуального развития связан с отсутствием Alu-элементов в генах Ya5NBC361 и АСЕ. Анализ ассоциаций Alu-элемента в гене АСЕ позволил установить взаимосвязь между наличием Alu-элемента и физическими способностями, в частности показателями максимального потребления кислорода (МПК) и общей физической работоспособности (ОФР). Показано, что высокий уровень МПК и ОФР ассоциирован с генотипом ACE*I/*I (P=0.05; OR=6.31; 95%CI 1.07-2.38 и P=0.01; OR=0.44; 95%CI 0.35-0.69 соответственно). Т.о., аллель АСЕ*I (несущий вставку) повышает показатель ОФР (P=0.01; OR=2.9; 95%CI 1.43-7.17) и МПК (P=0.05; OR=2.122; 95%CI 1.34-6.87), а аллель АСЕ*D понижает эти показатели (ОФР: P=0.01; OR=2.9; 95%CI 1.43-7.17; МПК: P=0.01; OR=0.70; 95%CI 0.14-0.75). По локусу Ya5NBC203 определен генетический профиль исследуемой выборки. Для всех изученных индивидуумов показан генотип *D/*D. Для гена P53 был изучен Alu-элемент, располагающийся в 6 интроне. При статистическом анализе частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов Alu-элемента в гене-супрессоре раковой опухоли р53 было обнаружено, что генотип *I/*I встречается в изученной выборке с частотой 0,3421, частота генотипа*I/*D составила 0,5903, а частота генотипа *D/*D 0,0676. Частота аллеля *I составила 0,6255, а частота аллеля *D – 0,3745. Было показано, что частоты встречаемости генотипа *I/*D у здоровых людей и у онкобольных достоверно различаются (p=0.011, OR=0,7815, 95%CI=0.658-0.945). Для определения роли Alu-элементов в инактивации гена р53 необходимо дальнейшее изучение влияния их инсерцирования, а также процессов возможной гомологичной рекомбинации между ними. Таким образом, проведенный анализ показал, что Alu-элементы за счет своей мобильности могут оказывать значительное влияние на геном. Для определения роли Alu-элементов в регуляции физиологических процессов человека необходимо дальнейшее детальное изучение их влияния на организм человека, будь то интеллектуальные особенности или какие-либо физиологические и биохимические показатели. В настоящее время Drosophila melanogaster – один из наиболее изученных в генетическом отношении видов. Ее геном был прочитан и расшифрован одним из первых – в 2001 г, наряду с геномами человека, домовой мыши и нематоды Caenorhabditis elegans. Сопоставление геномов дрозофилы и человека показало, что около 60% генов, нарушения функций которых приводит к возникновению наследственных заболеваний у человека, есть и у дрозофилы. Поэтому дрозофила активно используется как модель для исследования целого ряда наследственных болезней, в том числе, болезней Альцгеймера и Паркинсона. Была изучена структура мобильных элементов группы gypsy в стабильной и нестабильной линиях дрозофилы, изучена структура и регуляция действия гена flamenco, который контролирует транспозиции ретротранспозона gypsy. Биоинформатическими методами установлены филогенетические взаимоотношения между ретротранспозонами группы gypsy в геноме D. melanogaster. Проведен анализ их распределения методом ПЦР. Исследования проводились на видах, находящихся в разной степени филогенетического родства. Показано, что спектр и распределение исследованных ретротранспозонов различается в разных видах Drosophila в зависимости от степени родства с D. melanogaster, что позволяет установить эволюционный возраст этих элементов, а также указывает на возможность их межвидового горизонтального переноса. Проанализирована транспозиционная активность десяти ретротранспозонов в геномах генетически стабильной и генетически нестабильной линий D. melanogaster. В результате проведенного анализа было выявлено, что, по крайней мере, два ретротранспозона, ZAM и Idefix, имеют различное генетическое окружение в исследованных линиях, что, по-видимому, связано с их транспозицией. Проведен анализ экспрессии гена DIP1, основного кандидата на роль гена flamenco, в линиях дрозофилы, мутантных и нормальных по гену flamenco. Было проведено исследование закономерностей транспозиций ретротранспозонов группы gypsy в геноме линии дрозофилы, отличающихся по гену flamenco. Проведен анализ распределения ретротранспозонов группы gypsy в нескольких линиях дрозофилы, отличающихся по статусу гена flamenco, и исследована экспрессия генов дрозофилы – гомологов генов ретротранспозона-ретровируса gypsy (Grp и Iris). Нами выявлен и охарактеризован в геноме Drosophila melanogaster ген CG4680, который мы обозначили как Gag related protein, Grp, гомологичный гену gag ретротранспозонов группы gypsy (Потапова и др., 2009). Наряду с ним был выявлен и гомолог гена env, получивший название Iris. Продукт гена Grp обладает высоко консервативной структурой у разных видов семейства Drosophilidae и находится под действием стабилизирующего отбора, что предполагает наличие у него важной для дрозофилы геномной функции. Таким образом, этот ген не является простым псевдогеном gag, он функционален и приспособлен организмом для работы на собственные нужды. Исследование функции мобильных элементов несомненно, позволит приблизиться к пониманию механизмов регуляции и контроля транспозициями ретроэлементов, гомеостаза генома и иммунитета. Для решения и этих задач актуальными являются исследования ретротранспозонов, имеющих структурное сходство с gypsy.