ИСТИНА

Фосфор (P) – важнейший биогенный элемент, необходимый всем живым организмам. Фосфорные удобрения – основа современного интенсивного сельского хозяйства, в настоящее время вырабатываются из дефицитного минерального сырья, запасы которого неумолимо сокращаются. Эффективность использования фосфатов в настоящее время не превышает 20%, 80% выносится со сточными водами в водоемы, где P вызывает эвтрофикацию. Значительным потенциалом для изъятия P из сточных вод и его возврата в агроэкосистемы обладают одноклеточные оксигенные фототрофы (микроводоросли). Однако имеющихся знаний о поглощении P клетками микроводорослей, в особенности в средах, богатых P (т.н. избыточного поглощения, luxury P uptake), а также о регуляции этого процесса и влиянии на него различных факторов среды недостаточно. Цель проекта – исследование регуляции и кинетических параметров избыточного поглощения ортофосфата клетками миксотрофных микроводорослей в присутствие различных уровней органического и неорганического углерода. Особое внимание планируется уделить поиску подходов к управлению поглощением P и генов-регуляторов, контролирующих запасание P в клетке. Проект закладывает теоретические основы для применения микроводорослей в процессах и технологиях, обеспечивающих устойчивое использование P в сельском хозяйстве.

В ходе первого года были исследованы кинетические параметры избыточного поглощения ортофосфата клетками миксотрофных микроводорослей у микроводорослей Chlorella vulgaris CCALA 256, Chlorella vulagris IPPAS C1, Parachlorella kessleri CCALA 251, Chlorella vulgaris 711-54. Были отработаны оптимизированные протоколы выделения нуклеиновых кислот из биомассы микроводорослей, для Chlorella vulgaris IPPAS 711-54 получены геномные библиотеки, выполнено первичное секвенирование библиотек, проведена черновая сборка генома. За отчетный период (второй, заключительный год реализации проекта) была исследована динамика внутриклеточных резервов фосфора по данным 31P-ЯМР, Конфокальной микро-спектроскопии комбинационного рассеяния (confocal Raman micro-spectrometry) и аналитической просвечивающей электронной микроскопии (метод EDX – анализа энергодисперсионных спектров). Была описана характерная морфология внутриклеточных включений, содержащих резервы фосфора у нескольких видов микроводрослей из родов Chlorella, Parachlorella и Desmodesmus, включая их отличия от включений, содержащих резервы азота. Установлено, что при возобновлении фосфорного питания после фосфорного голодания в период лаг-фазы (до 2-4 часов после добавления к культуре фосфора) наблюдается быстрое образование полифосфатов в клетках. После возобновления клеточного деления (на экспоненциальной фазе роста) накопленные резервы фосфора расходуются, что сопровождается исчезновением включений (через 4-6 часов). Повторное накопление полифосфатов наблюдается, начиная с ранней стационарной файлы, по мере замедления клеточного деления в присутствие избытка неорганического фосфата в среде. Также были исследованы в сравнительном плане состав и соотношение основных классов липидов Chlorella vulgaris и их жирнокислотный профиль при фосфорном голодании и возобновлении фосфорного питания в связи с динамикой фотосинтетической активности. Общая картина изменений согласуется с наблюдаемыми изменениями физиологических параметров клеток. Так, при фосфорном голодании наблюдается редукция фотосинтетического аппарата и соответствующее снижение пропорции основных структурных липидов хлоропластов (гликолипидов), а также повышение доли нейтральных резервных липидов в сумме липидов клеток и ожидаемое снижение пропорции фосфолипидов. Возобновление фосфорного питания приводит к повышению фотосинтетической активности, развитию ассимиляционного мембранного аппарата хлоропластов. Соответственно, среди гликолипидов (и суммарных липидов клеток в целом) повышается пропорция моногалактозилдиацилглицеринов и снижается пропорция дигалактозилдиацилглицеринов (последняя является индикатором стрессовых воздействий). Среди жирных кислот уменьшается пропорция мононенасыщенных ЖК, в частности, олеата (18:1) и увеличивается содержание ди- и триненасыщенных длинноцепочечных жирных кислот, ассоциированных преимущественно со структурными липидами мембранного аппарата хлоропластов. Результаты исследований, выполненных в рамках настоящего проекта, потенциально могут быть использованы при разработке технологий для биологического изъятия фосфора из сточных вод [Solovchenko, A., A. M. Verschoor, N. D. Jablonowski and L. Nedbal (2016). "Phosphorus from wastewater to crops: An alternative path involving microalgae." Biotechnology advances 34(5): 550–564]. Однако, сточные воды, наряду с высокими концентрациями биогенных элементов, содержат значительные количества органических веществ. Кроме того, для повышения продуктивности культур при очистке сточных вод с использованием микроводорослей предлагается использовать обогащение среды неорганическим углеродом путем барботирования их дымовыми газами. Однако влияние избытка углерода (как органического, так и неорганического) на поглощение клетками микроводорослей неорганического фосфора из сред, богатых этим элементом, до исх пор не охарактеризовано. В этой связи были проведены эксперименты по культивированию Chlorella vulgaris на среде, обогащенной органическим (в виде ацетата натрия) и (или) неорганическим источником углерода (в виде смеси газообразного CO2 с атмосферным воздухом в соотношении 20:80; рис. 3−5 в приложенном полнотекстовом отчете). Установлено, что обогащение неорганическим углеродом оказывает более существенное влияние на рост культур изученного штамма Chlorella vulgaris, чем обогащение органическим углеродом. При этом одновременное обогащение двумя источниками углерода незначительно снижало скорость роста культур. Параллельно оценивали фотосинтетическую активность методом измерения потенциального максимального фотохимического квантового выхода фотосистемы II по переменной флуоресценции хлорофилла а. Обогащение культуры органическим источником углерода в виде ацетата натрия (при поддержании pH на постоянном уровне в области нейтральных значений) приводило к угнетению фотосинтетической активности, судя по значениям квантового выхода фотосистемы II. По-видимому, это свидетельствовало о переходе культуры к гетеротрофному росту, способность к которому является характерной чертой представителей рода Chlorella. Несмотря на снижение фотосинтетической активности при культивировании на среде с ацетатом, именно в этих вариантах, также характеризовавшихся более высокой скоростью деления клеток, также наблюдали максимальную скорость поглощения неорганического фосфора. При этом обогащение культур CO2 не оказывало видимого эффекта на скорость поглощения ортофосфата. По всей видимости, поглощение ортофосфата в наших экспериментальных условиях (экспоненциальный рост культур) определялось, главным образом, скоростью деления клеток. Таким образом, ускорение роста культур при обогащении среды органическим углеродом способствовало более эффективному изъятию фосфора из среды. Кроме того, в отчетном периоде были получены данные о генах, дифференциально экспрессирующихся в клетках при фосфорном голодании и при избыточном поглощении фосфора. С этой целью были отсеквенированы транскриптомы клеток, находящихся в разном состоянии по фосфорному питанию (голодающие по фосфору, обеспеченные фосфором на экспоненциальной и на стационарной фазах роста). В итоге было получено более 20 ГБ первичных данных (коротких чтений), из которых был собран транскриптом de novo. В полученной сборке путем сверки с БД InterPro было предсказано более 20 000 функциональных доменов, которым было сопоставлено более 5000 терминов Gene Ontology. Были рассчитаны уровни дифференциальной экспрессии, по результатам были отобраны гены, потенциально отвечающие за индукцию избыточного поглощения фосфора из среды. Показано, что при возобновлении фосфорного питания происходит отключение механизмов экономии фосфора в клетках (снижается экспрессия определенных эндонуклеаз), происходит замена высокоаффинной системы транспорта ортофосфата на низкоаффинную, а также индукция ферментативного аппарата для синтеза полифосфатов (полимераз полифосфатов из семейства VTC, vcuolar transporter shaperone). Предполагается, что скорость и степень накопления полифосфатов в клетках исследованных микроводорослей определяется соотношением скоростей поступления неорганического фосфора в клетку и расходования фосфора на биосинтез структурных компонентов клетки и вовлечения фосфора в биосинтетические пути центрального метаболизма. Немаловажное значение имеет общее состояние клетки (фотосинтетическая и метаболическая активность), поскольку биосинтез полифосфатов является энергоемким процессом. Также существенное влияние на формирование внутриклеточных резервов оказывают иные лимитирующие факторы и стрессоры, напрямую не связанные с поступлением неорганического фосфора в клетку, но замедляющие деление клеток.