| Результаты этапа: 1. Молекулярно-филогенетическое исследование рода Thismia и эволюция морфологических признаков.
В соответствии с заявленными целями, основными в 2018 году являются результаты молекулярно-филогенетического исследования рода Thismia. На начальных этапах исследования был составлен каталог имеющихся образцов, которые планируется включить в филогенетический анализ. Этот список насчитывает 28 образцов, относящихся к 24 видам (Shepeleva et al., submitted: Table A.1). Большая часть образцов была получена от коллег, часть собрана в природе М.С. Нуралиевым, а также один образец (T. annamensis) взят из коллекции БИН РАН (гербарий LE) в ходе поездки М.С. Нуралиева. Важно, что значительная часть этих образцов представляют типовые сборы; кроме того, подавляющее большинство использованных образцов документировано прижизненными фотографиями, что обеспечивает их надежное определение и сравнение друг с другом.
Для выбранных образцов были получены последовательности трех участков ДНК: двух ядерных (один из них - спейсер ITS1, ген 5.8S рРНК и спейсер ITS2 (далее, для краткости, этот маркер называется ITS) и второй - ген 18S rRNA) и одного митохондриального (ген atp1). В большинстве случаев было использовано секвенирование по Сэнгеру. Для десяти образцов, для которых результаты применения этого метода оказались неудовлетворительными, было применено секвенирование нового поколения (NGS). Для подавляющего большинства изученных видов данные о последовательности ДНК получены нами впервые. К полученному набору последовательностей были добавлены последовательности, хранящиеся в базе данных GenBank, после чего список включенных в анализ образцов насчитывал 42 вида рода Thismia, а также 12 видов из семейств порядка Dioscoreales (Thismiaceae, Burmanniaceae, Dioscoreaceae и Taccaceae), выбранных в качестве внешней группы. В итоге, выборка составила более половины всех известных видов рода Thismia (около 76 видов). Таким образом, нами впервые был осуществлен молекулярно-филогенетический анализ рода Thismia на основании репрезентативной выборки.
При построении филогенетических деревьев мы изначально использовали три метода: метод максимальной экономии, метод максимального правдоподобия и байесовский подход. Однако реконструкции, полученные методом максимальной экономии, имели крайне низкое разрешение, что согласуется с выводами других исследователей о сложности применения этого метода для изучения микогетеротрофных растений (например, Lam et al., 2018); кроме того, этот метод является чувствительным к выбору наиболее базального таксона (укоренению), что создает дополнительные сложности в его применении к представителям порядка Dioscoreales, так как родственные отношения (и объем) семейств в этом порядке до сих пор остаются очень спорными. По этим причинам нашим основным результатом по данному разделу являются реконструкции, полученные двумя другими методами.
Реконструкции, полученные при помощи метода максимального правдоподобия и байесовского подхода по комбинированному набору данных из трех участков, имеют высокую степень конгруэнтности (Shepeleva et al., submitted: Fig. 2, 3). Они согласуются с результатами других авторов в том, что единственный неотропический вид, включенный в анализ (T. panamensis), не является близко родственным остальным представителям рода Thismia, то есть род Thismia является полифилетичным. В наших реконструкциях T. panamensis группируется с монотипным родом Tiputinia с высокими уровнями поддержки; оба этих вида произрастают в лесах Амазонии. Остальные образцы рода Thismia в нашем исследовании образуют монофилетическую группу, обозначенную нами как Клада Thismia Старого Света. В пределах этой клады нами впервые выявлено пять основных клад, обладающих высокими уровнями поддержки. Важно, что эти клады хорошо согласуются с географическим распространением видов. Клада 1 включает шесть видов, распространенных на материковой части Восточной и Юго-Восточной Азии, а также на островах Восточной Азии. Клада 2 состоит из четырех видов Юго-Восточной Австралии и Новой Зеландии. Ареал всех семи видов Клады 3 ограничен островом Борнео. Клада 4 представлена шестью видами из Вьетнама и Таиланда. Клада 5, самая крупная (10 видов), имеет распространение от Гонконга до Борнео. Помимо этого, родственные связи нескольких видов является не до конца установленными, поскольку их положение в деревьях сильно варьирует в зависимости от выборки таксонов и используемых участков ДНК. В целом, оба метода реконструкции показывают организацию Клады Thismia Старого Света как грады, в которой группы расположены в следующем порядке (от дистальных к проксимальным): Клада 1, Клада 2, T. minutissima, Клада 3 + T. viridistriata, Клада 4, остальные виды Старого Света.
Виды, представленные в анализе более чем одним образцом (в том числе, из географически удаленных популяций), обнаружили определенную внутривидовую изменчивость. Тем не менее, все они представляют собой монофилетические группы, за исключением T. mucronata два образца которого имеют неопределенное положение относительно образца T. puberula.
Мы сопоставили полученные молекулярно-филогенетические реконструкции с существующим внутренним таксономическим делением рода Thismia. Наши данные подтверждают монофилетичность подрода Thismia, который на нашей выборке соответствует Кладе Thismia Старого Света. Остается неясным, правомерно ли включение в этот подрод его единственного представителя из Нового Света, T. americana, поскольку этот вид является вымершим и не обнаруживался со времен своего открытия более 100 лет назад. Монофилетичность второго подрода рода Thismia, Ophiomeris, также остается под вопросом, так как в анализ включен только один вид этого подрода. Ясно лишь, что подроды Thismia и Ophiomeris не являются сестринскими группами. Подразделения (секции и подсекции) подрода Thismia, принятые в наиболее поздней таксономической сводке по роду (Kumar et al., 2017), основанной на рядке более ранних фундаментальных работ (Jonker, 1938, 1948; Maas et al., 1986, Merckx and Smets, 2014), в большинстве своем являются полифилетичными, что впервые показано в нашем исследовании. Из шести секций подрода Thismia только одна (секция Scaphiophora с двумя видами) не представлена в филогенетическом анализе. Секция Geomitra (также из двух видов, T. betung-kerihunensis и T. clavigera) является монофилетичной и располагается в пределах Клады 3 на наших деревьях. Представители секций Rodwaya и Glaziocharis рассеяны между Кладами 1 и 2; с другой стороны, если переместить единственный азиатский вид секции Rodwaya, T. huangii, в секцию Glaziocharis и, аналогично, единственный австралийский вид секции Glaziocharis, T. clavarioides, в секцию Rodwaya, то обе секции Glaziocharis и Rodwaya будут полностью соответствовать кладам 1 и 2. Виды крупной секции Sarcosiphon в основном помещаются в Кладе 4, но некоторые ее виды - в Кладе 3. Типовая секция, Thismia, подразделяется на два подсекции. Клада 5 соответствует подсекции Odoardoa за исключением T. neptunis, относящейся к подсекции Brunonithismia; большинство остальных видов последней подсекции занимают изолированное (и не до конца определенное) положение, в основном вблизи Клад 4 и 5.
Как показывают наши данные, многие недавно обнаруженные виды Thismia были достаточно искусственно помещены в существующую таксономическую систему рода различными авторами, включая Kumar et al. (2017). На самом деле, многие из недавних находок представляют отдельные, неизвестные ранее линии эволюции, которые, вероятнее всего, заслуживают выделения в самостоятельные (еще не описанные формально) внутриродовые таксоны. Это особенно верно для представителей Клады 3, из которой только один вид (T. clavigera), обладающий достаточно необычной для этой клады морфологией, был известен до 2010 года, а также клады 4, в которой один из видов описан в 1965 году, а остальные в 21 веке. Представители обеих этих клад были абсолютно неизвестны во времена работ Jonker (1938, 1948), которые до сих пор являются основой для таксономии рода Thismia.
Полученные молекулярно-филогенетические реконструкции позволили нам впервые проанализировать морфологическую эволюцию рода Thismia с учетом репрезентативных молекулярных данных. На основании изучения литературных источников и имеющихся образцов мы отобрали 12 морфологических признаков, являющихся потенциально ценными для систематики рода Thismia и наиболее важными для изучения эволюции семейства Thismiaceae (Shepeleva et al., submitted: Table A.2). Часть признаков традиционно использовалась для разграничения внутриродовых таксонов Thismia, другие предложены нами для использования впервые.
Для каждого признака мы произвели кодирования его состояний, руководствуясь принципами Brazeau (2011). В частности, мы избегали выделения комплексных признаков, заключающих в себе сразу несколько морфологических особенностей. Ниже приведен список выделенных признаков и их состояний.
1 - Подземная часть: горизонтальные червевидные корни (0); коралловидные корни (1); клубневидные корни (2); нитевидные корни (3); короткое корневище с пучками небольших корневых клубеньков (4); вертикальное цилиндрическое симподиально ветвящееся (5); клубень (6).
2 - Симметрия цветка: актиноморфия (0); зигоморфия (1).
3 - Трансверзальные перекладины на внутренней поверхности гипантия: отсутствие (0); присутствие (1).
4 - Строение внутреннего круга околоцветника: листочки свободные (0); листочки срастаются в митру (1); листочки перекрываются с образованием неплотного купола (2).
5 - Ямки на поверхности митры: отсутствие (0); присутствие (1). Виды без митры закодированы как “-”.
6 - Придатки внутренних листочков околоцветника: отсутствуют, либо менее 1.5 мм длиной (0); присутствуют, более 1.5 мм длиной (1).
7 - Придатки митры, расположенные в ее центре: свободные друг от друга (0); срастаются в колонку (1). Виды без митры закодированы как “-”.
8 - Придатки наружных листочков околоцветника: отсутствуют (0); присутствуют (1). Виды без наружных листочков околоцветника закодированы как “-”.
9 - Число тычинок: 3 (0), 6 (1).
10 - Связники тычинок: свободные (0); постгенитально срастаются в тычиночную трубку (1).
11 - Межтычиночные железки: отсутствуют (0); присутствуют (1).
12 - Крыловидные придатки связника: отсутствуют (0); присутствуют (1).
Разработанная нами система признаков и их состояний имеет ряд существенных отличий от системы, использованной более ранними исследователями (Merckx and Smets 2014) для проведения кладистического анализа рода Thismia по морфологическим признакам. Одним из них является выделение трех состояний строения внутреннего круга околоцветника (признак 4): нами впервые выделено состояние 2, "неплотный купол", как отдельное от состояния "митра". В отличие от митры, неплотный купол характеризуется черепитчатым (а не створчатым) расположением листочков околоцветника, которые к тому же остаются чаще всего свободными (отсутствует срастание), так что подобие митры возникает чисто в силу их расположения над отверстием гипантия.
Реконструкция эволюции морфологических признаков проводилась на основе байесовского дерева, построенного по трем маркерам (ITS+18S+atp1), в котором для каждого вида оставлен единственный образец (т.е. дерево образцов конвертировано в дерево видов). Для реконструкции использовался метод максимального правдоподобия (Shepeleva et al., submitted: Fig. 4-7, Suppl. Fig. 9-12).
Один из изученных признаков (признак 9, число тычинок) является неизменным в пределах Клады Thismia Старого Света. У большинства остальных признаков мы выявили более или менее гомопластичный характер эволюции в этой кладе - вывод, тесно связанный с выводом о немонофилетичности многих внутриродовых таксонов Thismia, выделенных на основании данных морфологии. Наличие крыловидных придатков связника (признак 12) является единственным признаком, полностью согласующимся с молекулярно-филогенетической реконструкцией: эти придатки появляются один раз в эволюции рода Thismia, и случаи их исчезновения (реверсии) отсутствуют.
Мы обнаружили, что изменения состояния признаков строения цветка в Кладе Thismia Старого Света можно рассмотреть как постепенное накопление структурных усложнений, что, вероятно, связано с усложнением механизмов опыления. При этом многие структурные "надстройки" происходили в разных линиях эволюции параллельно. Эти усложнения следующие: появление зигоморфии (3 случая), появление трансверзальных перекладин на внутренней поверхности гипантия (несколько случаев), объединение листочков внутреннего круга околоцветника в митру или их расположение в виде неплотного купола (около 6 случаев суммарно; но также один случай реверсии к свободным листочкам в Кладе 5), появление придатков наружных листочков околоцветника (4 случая). Трубка тычинок, вероятнее всего, возникла в основании Клады Thismia Старого Света и исчезла у двух видов Клады 1.
Изолированное филогенетическое положение ряда видов (T. gardneriana, T. javanica и T. tentaculata), не отнесенных ни к одной из пяти основных клад, до некоторой степени согласуется с морфологическим своеобразием этих видов. В целом, три этих вида морфологически сходны с видами Клады 5, к которой они близки согласно байесовской реконструкции. Основным отличием этих трех видов является отсутствие придатков наружных листочков околоцветника. Эти виды, таким образом, уникальны среди рода Thismia тем, что имеют одновременно свободные внутренние листочки околоцветника (что всегда совпадает с наличием придатков у этих листочков) и наружные листочки без придатков.
Несмотря на выявленную нами высокую гомопластичность морфологических признаков, выбранные признаки позволили составить уникальную (в пределах Клады Thismia Старого Света) морфологическую характеристику каждой из пяти основных клад. Все виды Клады 1 характеризуется отсутствием крыловидных придатков связника, при этом этот признак не встречается вне этой клады. Также у видов Клады 1 отсутствуют трансверзальные перекладины на внутренней поверхности гипантия и межтычиночные железки. Наконец, это единственная клада, в которой имеются виды со свободными тычинками (наряду с видами с тычиночной трубкой). Клада 2 характеризуется отсутствием трансверзальных перекладин на внутренней поверхности гипантия, наличием придатков внутренних листочков околоцветника, митрой, отсутствием ямок митры, наличием межтычиночных железок. Клада 3 характеризуется коралловидными корнями, митрой, отсутствием ямок митры, наличием межтычиночных железок; также она включает единственные два вида (в нашем анализе) с придатками митры, расположенными в ее центре. Клада 4 характеризуется отсутствием трансверзальных перекладин на внутренней поверхности гипантия, отсутствием придатков внутренних и наружных листочков околоцветника, митрой; синапоморфией этой клады является наличие ямок митры, которые имеются у четырех из шести ее видов. Клада 5 характеризуется свободными внутренними листочками околоцветника и наличием придатков внутренних и наружных листочков.
На основании проведенного анализа мы предлагаем набор из четырех структурных признаков, использование которых достаточно для составления уникальных морфологических описаний пяти выявленных клад: строение подземной части, строение внутреннего круга околоцветника, наличие придатков внутренних листочков околоцветника, наличие придатков тычинок. В дополнение, предлагается использовать наличие трансверзальных перекладин на внутренней поверхности гипантия. В совокупности с четким географическим распределением выявленных клад, перечисленные признаки указывают на высокую достоверность результатов молекулярно-филогенетического анализа, а также создают базу для создания новой таксономической системы рода и определительных ключей монофилетических внутриродовых таксонов. Наши данные указывают на важность применения единой терминологии при исследованиях семейства Thismiaceae и необходимость установления истинной морфологической природы тех или иных частей растения.
По результатам комплексного исследования, описанного в этом разделе, подготовлена рукопись статьи на английском языке, которая подана в журнал Molecular Phylogenetics and Evolution (Shepeleva et al., submitted).
2. Морфолого-анатомическое изучение цветка одного из видов Thismia.
Для одного из видов, Thismia annamensis, изготовлены серийные поперечные срезы цветков, как дефинитивных, так и на поздних стадиях развития. Для репрезентативного числа срезов были получены их цифровые изображения при помощи микроскопа, укомплектованного фотокамерой.
Изучение морфологии цветка позволило уточнить ряд его структурных особенностей. Так, у недоразвитого цветка, в отличие от готового к цветению, плаценты не имеют вид трех свободных колонок, а расположены постенно, в углах единого гнезда завязи. Вероятнее всего, в ходе развития цветка происходит отрыв плацент от стенки завязи, и гинецей, таким образом, сочетает в себе черты паракарпного и лизикарпного. Детали этого процесса будут уточняться на дополнительном материале в ходе дальнейших работ по проекту. Затем, установлено, что медианные пучки листочков околоцветника продолжаются в длинные нитевидные придатки листочков. Это наблюдение ставит под вопрос корректность описания данных структур как придатков; в качестве альтернативной гипотезы следует рассмотреть признание нитевидных структур верхушками листочков, а широких лопастей в их основании - крыловидными придатками.
На основании срезов создана реконструкция васкулярной системы цветка. Васкулатура дефинитивного цветка устроена следующим образом. В цветоножке имеется шесть васкулярных тяжей, располагающихся кольцом. Они расположены в два круга: внешний (тяжи «W») и внутренний (тяжи «T»). Тяжи «Т» формируют следы чешуй. Каждый из трех пучков «Т» ветвится в тангентальной плоскости на два пучка. Образовавшиеся пучки «T2», «T4», «T6» располагаются между плацентами. Пучки «T1», «T3», «T5» располагаются напротив плацент. Далее пучки «T1», «T3», «T5» ветвятся в радиальной плоскости с образованием двух пучков: «^P» и «G». Пучки «G» питают гинецей, пучки «^P» питают листочки околоцветника. Пучки «T2», «T4», «T6» ветвятся каждый с образованием четырех пучков: продолжающийся выше пучок «*P», два ответвления в тангентальной плоскости (пучки «p»), одно – в радиальной (пучки «G»). Пучки «p» и «*P» питают листочки околоцветника, пучки «G» - гинецей. Таким образом, насчитывается шесть пучков, питающих гинецей, и двенадцать пучков, питающих листочки околоцветника. Проследить дальнейший путь пучков, питающих гинецей, не удается. В гипантии пучки «*P» и «^P» ветвятся в радиальной плоскости с образованием тычиночных пучков («*S» и «^S» соответственно) и продолжаются в листочек околоцветника («*P» – в листочек внутреннего круга, «^P» - внешнего круга), где становятся медиальными следами этих листочков. Пучки «p» выше места ответвления тычиночных пучков делятся в тангентальной плоскости с образованием двух ветвей: «p”» продолжается в листочек внешнего круга околоцветника, «p’» – в листочек внутреннего. В листочках околоцветника эти ветви делятся тангентально с образованием латеральных пучков. В дефинитивных цветках эти пучки ветвятся с образованием трех латеральных пучков в листочках внешнего круга и двух в листочках внутреннего. Всего формируется 7 пучков, питающих листочек внешнего круга, и 5 пучков, питающих листочек внутреннего круга. В молодых цветках прослеживается ветвление только пучка, иннервирующего листочек внешнего круга, с образованием двух пучков («p”»). В итоге, листочки внутреннего круга околоцветника имеют три пучка, листочки внешнего – пять пучков.
Таким образом, нами впервые прослежено прохождение проводящих пучков у представителя рода Thismia на непрерывной серии поперечных срезов. В рамках нашей реконструкции обнаружился крайне необычный способ иннервации околоцветника, при котором и внешние, и внутренние листочки имеют латеральные пучки, но все латеральные пучки не имеют связи с медианными пучками листочков: они берут начало от шести общих "стволовых" пучков, каждый из которых лежит между соседними внешним и внутренним листочком и образует латеральные пучки их обоих с соответствующих сторон. Признаки васкулатуры T. annamensis буду сопоставлены с таковыми других видов Thismia, которые планируется изучить в 2019 году.
3. Палинологическое исследование Thismia.
Была впервые исследована морфология пыльцы 6 видов (9 образцов) Thismia: T. mucronata (2 образца), T. annamensis (3 образца), T. alba, T. brunneomitroides, T. tentaculata, T. angustimitra (по 1 образцу). Все виды относятся к одному палиноморфологическому типу. Пыльцевые зерна мелкие, плоско-выпуклые, с одной порой 1-2 мкм диаметром. Положение поры неясное, предположительно экваториальное. Экзина покровная, гладкая или слегка шероховатая, на светооптическом уровне однослойная, гомогенная, столбиковый слой не заметен. На изображениях, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа, поверхность экзины гладкая или мелкоперфорированная, виды различаются по микроскульптуре экзины (числу и размеру перфораций). Гладкая экзина без видимых ямок и перфораций характерна для T. annamensis, T. alba и T. brunneomitroides, последний вид отличают самые мелкие размеры пыльцевых зерен (10.5-13.6 х 7-7.5 мкм). Мелкие перфорации (не более 0,1 мкм диаметром) типичны для экзины T. mucronata и T. angustimitra. Исследованные нами образцы различаются между собой по числу ямок на единицу поверхности пыльцевого зерна, однако этот признак может варьировать в пределах вида. Для T. angustimitra характерны также самые крупные пыльцевые зерна из изученных (20-25 х 15-18 мкм). Наиболее ярко выражен рельеф поверхности экзины у T. tentaculata с многочисленными округлыми ямками и перфорациями до 0.4-0.5 мкм диаметром. Число ямок и перфораций варьирует в пределах одного образца.
Таким образом, нами впервые проведено изучение палинологического разнообразия Thismia Старого Света, позволяющее оценить внутри- и межвидовое варьирование основных признаков строения пыльцы в этом роде. Более ранние исследования (Rübsamen, 1986; Caddick et al., 1998) включали лишь три вида этой группы. Наши результаты охватывают три из пяти основных клад Thismia, выявленных в ходе нашего молекулярно-филогенетического исследования (см. выше), что указывает на целевые группы видов для будущих работ.
4. Изучение таксономического разнообразия и географического распространения микогетеротрофных растений в тропической Азии.
В ходе обработки флористического материала было проведено определение образцов микогетеротрофных растений Вьетнама и Лаоса из семейств Ericaceae, Orchidaceae, Burmanniaceae. По результатам определения было выявлено две новые находки видов рода Burmannia (Burmanniaceae, Dioscoreales). Burmannia nepalensis впервые обнаружен во флоре Лаоса. Этот вид является вторым известным нефотосинтезирующим представителем рода в Лаосе. Burmannia lutescens впервые обнаружен во флоре Вьетнама. Данная находка является достаточно неожиданной, поскольку ранее этот вид считался эндемиком малезийского региона и, вероятнее всего, никогда не обнаруживался на территории материковой Азии. Таким образом, новая находка существенно расширяет известный ареал B. lutescens, а также является очередным подтверждением идеи о значительном флористическом сходстве южного Вьетнама и северной Малезии. Вместе с нашей находкой во флоре Вьетнама на данный момент насчитывается семь микогетеротрофных видов рода Burmannia. Результаты изучения географического распространения видов Burmannia опубликованы в виде статьи в международном журнале Wulfenia (Nuraliev et al., 2018).
|
| Результаты этапа: 1. Развитие молекулярно-филогенетического анализа.
Были получены последовательности ДНК для нескольких дополнительных образцов Thismia с целью уточнения определения образцов, тестирования монофилетичности видов и выявления внутривидовой вариабельности изученных участков ДНК. Подтверждено определение образцов T. annamensis, существенно отличающихся от типового образца по окраске цветка и по признакам размера и формы (длина придатков листочков околоцветника, диаметр аннулюса и др.). Так, образец Nuraliev 1644 показал 100%-ое сходство участков 18S и atp1 с таковыми образцов, изученных нами ранее (включая типовой). Образец Vuong BV426, предварительно определенный как T. javanica, по строению участка atp1 является промежуточным между имеющимися последовательностями двух морфологически сходных с этим образцом видов, T. javanica и T. tentaculata. При этом из 840 позиций выравниваемого участка 827 идентично с T. javanica, и 824 с T. tentaculata. Таким образом, молекулярные данные не противоречат текущему определению образца Vuong BV426 (как T. javanica), но также могут говорить в пользу принадлежности к какому-то третьему виду.
2. Изучение пластидных геномов и поиск дополнительных ДНК-маркеров для изучения филогении среди пластидных участков.
Были проведены исследования, направленные на определение первичной структуры и аннотацию пластидных геномов видов Thismia. Были подготовлены библиотеки для высокопроизводительного секвенирования и проведено секвенирование для 6 видов: T. mucronata, T. annamensis, T. hexagona, T. puberula, T. thaitongiana и T. gardneriana. Общий объем секвенирования составил 232 074 738 чтений длиной 150+150 нуклеотидов.
Для пластидных геномов Thismia характерно сильно повышенное содержание АТ-оснований, в малой однокопийной области доходящее до 92%. Это приводит к неравномерности в покрытии (известно, что экстремально АТ-богатые, как и GC-богатые, области секвенируются хуже, чем участки с более равномерным нуклеотидным составом). Так, отличия в покрытии инвертированного повтора (inverted repeat, далее IR) и малой однокопийной области доходит до 10 раз, что создает дополнительные сложности в сборке и аннотации. Сборку проводили с помощью программы CLC Genomics workbench v.9.5.4, затем дальнейший отбор контигов – на основании анализа покрытия и сходства с пластомом T. tentaculata. Отобранные контиги (их число составляло от 2 до 4) затем проверяли с использованием blast2seq на предмет перекрывания, и перекрывающиеся контиги объединяли. Предполагаемые места стыков IR и однокопийных областей проверяли при помощи картирования чтений на сборку. Таким образом мы получили полные последовательности для 4 видов (T. mucronata, T. puberula, T. thaitongiana и T. gardneriana: Fig. 1-3, 5 в постере Yudina et al., 2019). Для T. annamensis и T. hexagona было получено 2 контига, предположительно соответствующих IR и большой однокопийной области. Они имеют покрытие 360х и 144х соответственно. С учетом сказанного выше, возможно, объем секвенирования для этого вида недостаточен для сборки малой однокопийной области. В образце T. hexagona были обнаружены последовательности другого микогетеротрофного растения, Epirixanthes (Polygalaceae), вероятно, из-за контаминации при сборе, так как эти растения часто растут вместе (Sochor et al. 2018). Другие авторы (Lam et al. 2018) также указывали на распространенность контаминации при работе с гетеротрофными видами.
В итоге, дальнейшее сравнение состава и порядка генов проводили между видами, для которых получены полные последовательности. Большинство видов имеют состав генов, сходный между собой и с T. tentaculata, описанного ранее Lim с соавт. У всех определенных нами видов мы обнаружили ген rps3, не аннотированный у T. tentaculata. Анализ последовательности его пластидного генома, доступного в NCBI, показал, что у него этот ген тоже есть, также локализован в малой однокопийной области, но остался незамеченным, видимо, в связи с сильным смещением нуклеотидного состава в сторону АТ, что препятствует аннотации, основанной на поиске по сходству с близкими видами. Пластом T. thaitongiana представляет собой дальнейшую ступень редукции – размер его составляет ~ 14 Кб, у неё отсутствуют гены rps2 и rrn5. Сравнение структуры пластомов показывает, что положение инвертированного повтора них отличается. Так, у T. tentaculata IR включает гены rps18, rpl2, trnE и trnM. У T. thaitongiana он включает также оба экзона rps12, а у других изученных видов также rps2 и rrn5.
В работе Lim с соавт. было отмечено, что IR у тисмии не коллинеарен таковому у близкого фотосинтезирующего вида Tacca chantrieri и поставлен вопрос о том, происходило ли постепенное смещение границ повтора или он был утрачен, а потом возник de novo.
Обращает на себя внимание необычное положение генов rrn16 и rrn23 относительно друг друга. Эти гены кодируют большую и малую субъединицы рРНК, у подавляющего большинства видов они расположены рядом, на одной цепи и составляют часть одного оперона. Такое необычное расположение может говорить о том, что большая однокопийная область у тисмии произошла из IR путем утраты разных частей копий повтора, а также полной утраты расположенной между ними малой однокопийной области. Новая малая однокопийная область образовалась из участка, который у фотоситезирующего предка находился в большой однокопийной области и включал гены rps4, rps8 и rps3.
На основании набора пластидных маркеров (rps12 5’ end, accD, rpl2, trnE-UUC) построено молекулярно-филогенетическое дерево (Fig. 7, 8 в постере Yudina et al., 2019), которое не противоречит полученным нами ранее филогенетическим данным. Эти предварительные результаты говорят о перспективности использования данных маркеров для изучения филогения Thismia.
По полученным результатам сделан стендовый доклад на международной конференции (Yudina et al., 2019).
3. Анатомическое изучение цветка Thismia.
Для двух видов рода, T. mucronata и T. javanica, впервые получены серийные срезы цветков, причем как зрелых, так и сильно недоразвитых бутонов, что является важным дополнением к изучению развития цветка (Nuraliev et al., submitted, Fig. 4-6). Получены коллекции цифровых изображений срезов с использованием микроскопа и высококачественной фотокамеры, приобретенной в первый год выполнения проекта. На основании изучения срезов реконструирована васкулярная система цветков, которая проиллюстрирована в виде диаграмм (Nuraliev et al., submitted, Fig. 7).
Васкулярная система цветка Thismia javanica. В цветоножке имеется 3 пучка, лежащие на радиусах наружных листочков околоцветника («наружные пучки»). В цветоложе (под гнездом завязи) наружные пучки отделяют в тангентальной плоскости по две ветви, которые попарно сливаются между собой, образуя пучки, лежащие на радиусах внутренних листочков околоцветника («внутренние пучки»). В цветок входят шесть пучков: три внутренних и три наружных, чередующихся между собой. В стенке завязи внутренние пучки дихотомируют, отделяя в радиальном направлении ветви, иннервирующие колонки плацент (синвентральные пучки). Синвентральные пучки заканчиваются в плацентах слепо. В верхней части завязи наружные пучки отдают каждый по три ветви в радиальном и тангентальном направлениях, образуя два латеральных (по обе стороны от центрального наружного пучка) и один радиальный пучки. Радиальный пучок является дорзальным пучком плодолистика. В стенку гипантия входят 12 пучков: 3 внутренних, чередующихся с тремя группами из двух латеральных и одного центрального наружных пучков. Три дорзальных пучка плодолистиков, проходя через крышу завязи, иннервирует стилодии, где слепо заканчиваются. В верхней части гипантия, на уровне прикрепления тычинок, центральные наружные пучки и внутренние пучки дихотомически ветвятся в радиальной плоскости. Образованные ветви иннервируют тычинки в соответствии с радиусами, на которых они лежат. Латеральные наружные пучки разделяются каждый на две ветви, одна из которых продолжается в листочек внутреннего круга вместе с внутренним пучком, другая – в листочек наружного круга вместе с центральным наружным пучком. Листочки околоцветника иннервируются тремя пучками. Во внутренних листочках боковые пучки сливаются с центральным (медианным), который продолжается до конца придатка. В наружных листочках происходит аналогичное слияние; медианный пучок слепо заканчивается в пластинке листочка.
Васкулярная система цветка Thismia mucronata (Nuraliev et al., submitted, Fig. 7B). В цветоножке имеется 3 пучка, лежащие на радиусах наружных листочков околоцветника («наружные пучки»). Под гнездом завязи каждый из наружных пучков отдаёт две ветви в тангентальной плоскости, которые попарно сливаются между собой и дают начало пучкам, лежащим на радиусах внутренних листочков («внутренние пучки»). В основании завязи «внутренние» пучки посылают по два радиальных ответвления в плаценты (синвентральные пучки), где эти ветви слепо заканчиваются. Внутренние и наружные пучки продолжаются в стенке завязи. В верхней части завязи наружные пучки отдают каждый по три ветви в радиальном и тангентальном направлениях, образуя два латеральных (по обе стороны от центрального наружного пучка) и один радиальный пучки. Радиальный пучок является дорзальным пучком плодолистика. Три дорзальных пучка плодолистиков, проходя через крышу завязи, иннервируют стилодии, где слепо заканчиваются. В гипантий продолжаются двенадцать пучков: девять наружных пучков, включающих центральные и латеральные, и три внутренних. В верхней части гипантия внутренние пучки посылают ответвления в тычинки, доходящие до середины связников. Центральные наружные пучки становятся пучками тычинок, не претерпевая ветвления. Между центральным наружным пучком и двумя соседними с ним латеральными имеется горизонтальный анастомоз. Внутренние пучки продолжаются в листочки внутреннего круга околоцветника. Листочки внутреннего круга имеют по три следа: внутренний пучок и два наружных латеральных, лежащих по обе стороны от него. В наружных листочках боковые пучки сливаются с медианным. Листочки наружного круга не иннервируются.
С целью проведения сравнительного анализа мы построили диаграммы васкулатуры видов Thismia, анатомия цветков которых описана в литературных источниках (в основном по Rübsamen, 1986). Васкулатура цветка T. americana (Nuraliev et al., submitted, Fig. 8A) более всего близка к таковой T. annamensis с отличиями в иннервации околоцветника. У обоих видов каждый листочек околоцветника трехследовой. У T. americana пучки как наружных, так и внутренних листочков не ветвятся, и латеральные пучки сливаются с медианными пучками. Васкулатура цветка T. rodwayi (Nuraliev et al., submitted, Fig. 8B) отличается от таковой T. annamensis в двух областях. Первая область - иннервация околоцветника. У T. rodwayi три пучка каждого листочка не ветвятся и заканчиваются слепо. Вторая зона - переход между цветоложем и завязью. У T. rodwayi базальная часть завязи представлена синасцидиатной зоной. Вентральные пучки (т.е., иннервирующие плаценты) отходят от внутренних пучков периферического кольца непосредственно под гнездами завязи. Это происходит примерно на том же уровне, на котором ветви трех пучков цветоножки сливаются с образованием внутренних пучков, так что в цветке T. rodwayi имеет место значительная перегруппировка пучков в очень ограниченном пространстве. Также, у T. aseroe, изученного Rao (1969), васкулатура цветка до уровня верхушки гипантия идентична таковой T. annamensis; иннервация околоцветника в этой работе не изучена.
Таким образом, шесть видов Thismia, принадлежащих к кладе Старого Света, изученные к настоящему моменту обладают достаточно единообразной васкулатурой цветка, и основные отличия касаются иннервации листочков околоцветника. У одного вида, T. mucronata, наружные листочки не васкуляризованы. Примечательно, что у целой группы (вероятно, клады) азиатских видов Thismia, имеющих сходный с цветком T. mucronata облик цветка из-за наличия митры такого же строения, наружные листочки варьируют от практически незаметных до полностью отсутствующих. Поскольку наличие наружных листочков в кладе Thismia Старого Света является плезиоморфным состоянием, можно предположить тенденцию к их редукции в определенных группах родстве в ее пределах, которая в некоторых случаях реализуется в небольших неваскуляризованных лепестков, а в других - в виде их практического отсутствия. Другие вариабельные признаки связаны с наличием ветвлений и объединения пучков в пластинках листочков. Ветвление обнаружено только у T. annamensis, что связано, вероятно, с их крупными размерами. Срастание происходит между парными латеральными пучками и медианным пучком; оно отмечено у листочков обоих кругов T. americana и T. javanica, у внутренних листочков T. mucronata и у внутренней пары латеральных пучков в листочках обоих кругов T. annamensis. Примечательно, что листочки T. annamensis хотя и явзяются гомоморфными, обладают разной васкулатурой. Возможно, это связано с их почкосложением в бутоне, поскольку у внутренних листочков оно створчатое, а у наружных - открытое.
4. Морфогенетическое изучение цветка Thismia.
Для трех видов рода, T. mucronata, T. javanica и T. annamensis, проведена подготовка объектов к изучению методом СЭМ и их изучение. Получены коллекции СЭМ-изображений. Эти виды обладают контрастным внешним обликом и строением цветка: у T. mucronata наружные листочки околоцветника небольшие, а внутренние образуют митру, в то время как у T. annamensis наружные и внутренние листочки околоцветника гомоморфные, имеют крупную пластинку и длинные нитевидные отростки, в совокупности придающие цветку колесовидный облик.
Наиболее полный диапазон стадий развития цветка получен для T. mucronata (Nuraliev et al., submitted, Fig. 9-13). Надземный побег у этого вида завершается монохазиальным соцветием из нескольких (до трех) цветков, развивающихся последовательно. Каждая ветвь соцветия расположена в пазухе чешуи обертки цветка предыдущего порядка. В начале развития боковая ветвь имеет три примордия неравного размера, которые, вероятнее всего, представляют собой чешуи обертки. Центральная часть примордия ветви соцветия дает начало терминальному цветку. Боковая ветвь следующего порядка закладывается в пазухе одной из чешуй обертки.
Элементы цветка закладываются на ранних стадиях развития в следующем порядке:
(1) Шесть листочков околоцветника (относящихся к наружному и внутреннему кругам) закладываются одновременно друг с другом вокруг широкой центральной зоны, представляющей собой неиспольнованную к этому моменту меристему. Внешние листочки околоцветника чередуются с чешуями обертки, а внутренние листочки лежат напротив чешуй. Примордии листочков имеют одинаковый размер и равноудалены от центра цветка, то есть два круга околоцветника неразличимы на момент заложения и имеют вид единого круга. Цветок на этой стадии приблизительно 250 мкм в диаметре.
(2) Когда цветок достигает диаметра около 300 мкм, три отдельных стилодия (представляющих асимпликатную зону гинецея) закладываются вблизи центра цветка на радиусах внутренних листочков околоцветника. Стилодии, таким образом, представляют собой первые структуры гинецея, которые становятся заметны в ходе развития цветка. Как минимум в некоторых случаях, их заложение асинхронное, и один стилодий появляется позже, чем два остальных. Листочки околоцветника на этой стадии не претерпевают никаких существенных изменений.
(3) Вскоре после появления стилодиев, когда цветок имеет размер 300-350 мкм, Становятся различимы тычинки. На момент заложения они имеют вид выростов в местах прикрепления листочков околоцветника, центрипетальных (внутренних) по отношению к листочкам. Листочки околоцветника на этой стадии ориентированы вертикально, и тычинки вырастают перпендикулярно листочкам, то есть по направлению к центру цветка. На этой стадии, центральная меристема цветка, окруженная стилодиями, становится явно вогнутой, что может быть интерпретировано как первый признак появления единственного гнезда завязи (т.е. симпликатной зоны гинецея).
Вскоре после заложения тычинок появляются морфологические различия между наружными и внутренними листочками околоцветника: на абаксиальной стороне каждого наружного листочка вырастает придаток, расположенный вблизи его апекса (или, возможно, являющегося выростом непосредственно апекса). Кроме того, наружные листочки начинают налегать на внутренние. Появляется гипантий, который вырастает вследствие активного интеркалярного роста ниже оснований листочков околоцветника и тычинок. Вскоре после этого закладываются три плаценты, расположенные на радиусах внутренних листочков околоцветника (в париетальном положении). Изначально плаценты имеют вид широких вертикальных гребней на внутренней поверхности стенки завязи. На этой стадии цветок вырастает до 600 мкм в диаметре.
В ходе дальнейшего роста цветка средняя часть каждого внутреннего листочка околоцветника изгибается в сторону центра цветка, так что вертикально ориентированные дистальные части этих листочков касаются двух других внутренних листочков с образованием широкой контактирующей поверхности, которая, вероятно, представляет собой дистальную часть адаксиальной поверхности листочка. Таким образом, внутренние листочки околоцветника имеют створчатое почкосложение. Края наружных листочков ни на одной стадии не касаются друг друга. то есть их почкосложение открытое. Каждая тычинка удлиняется в базальном и в апикальном направлении относительно места ее прикрепления. Стилодия удлиняются, ткани в их основании разрастаются в горизонтальном направлении с образованием крыши завязи, при этом остается лишь узкий канал между близко расположенными основаниями стилодиев, соединяющий гнездо завязи с внешней средой. Плаценты увеличиваются и начинают занимать практически все пространство внутри гнезда завязи. Все эти изменения происходят, вероятнее всего, в течение короткого промежутка времени, поскольку размер цветка во время этих изменений остается приблизительно постоянным (около 400-600 мкм).
Когда цветок становится значительно крупнее, его части претерпевают последующую дифференциацию. Когда размер цветка достигает 800 мкм, его длина значительно превосходит ширину. Внутренние листочки околоцветника постгенитально срастаются друг с другом в зоне контакта, и таким образом формируется митра. Тычинки удлиняются и повисают в базипетальном направлении (то есть в направлении крыши завязи). Вероятнее всего, это происходит посредством резко неравного роста основания тычинки с гораздо более интенсивным ростом с верхней стороны, что приводит к перевороту всей тычинки, хотя мы не наблюдали промежуточных стадий этого мощного изгибания. В каждой тычинке две теки дифференцируются на адаксиальной стороне (обращенной к гипантию), а также надсвязник. Надсвязник изначально изогнут на 180° в абаксиальном направлении (противоположном относительно тек), и вся тычинка, таким образом, может быть описана на этой стадии как дважды изогнутая. В центральной части крыши завязи под основаниями тычинок интеркалярно вырастает столбик. Канал в столбике постгенитально зарастает с образованием трехлучевого рубца, и с этого момента гнездо завязи оказывается полностью изолированным. На плацентах закладываются многочисленные семязачатки, занимающие всю их поверхность. Сами плаценты вскоре после заложения семязачатков претерпевают серьезную трансформацию: они отделяются от стенки завязи вдоль всей своей длины за исключением наиболее проксимальных и дистальных участков. Отделение происходит за счет лизиса клеток. В результате плаценты становятся колонновидными. В итоге, к моменту достижения цветком диаметра около 1 мм (в сравнении с 6 мм у зрелого цветка) формируются все его основные части.
На заключительных этапах развития цветка появляются аннулюс, являющийся, вероятнее всего, результатом интеркалярного роста в области прикрепления листочков околоцветника и тычинок к гипантию (промежуточные стадии нами не были зарегистрированы). У каждой тычинки надсвязник значительно удлиняется (в сравнении с теками), выпрямляется и приобретает юбковидный придаток на адаксиальной стороне. Пыльники постгенитально срастаются между собой латеральными поверхностями, формируя трубку пыльников. На поверхности тычинок развиваются волоски нескольких типов, и в области швов срастания пыльников на адаксиальной стороне чуть дистальнее тек появляются межтычиночные железки. Плаценты станосятся прямыми, тонкими и отделены от стенки завязи обширным пустым пространством. Плаценты выглядят сплошь покрытыми семязачатками (вследствие отклонения семязачатков в область разрыва), так что париетальная природа плацент оказывается полностью замаскирована. Семязачатки становятся анатропными, битегмальными (внутренний интегумент развивается раньше наружного), с длинным фуникулусом.
Развитие цветка Thismia annamensis (Nuraliev et al., submitted, Fig. 14-16) протекает сходным образом со следующими отличиями. Соцветие содержит до семи цветков. После заложения тычинок, когда цветок имеет размер около 450 мкм в диаметре, не прослеживается никаких различий в строении наружных и внутренних листочков околоцветника. листочки обоих кругов становятся очень широкими (явно шире, чем листочки у T. mucronata на этой стадии), с утолщенной центральной частью и уплощенными краями. Наружные листочки значительно налегают на внутренние. Придатки листочков на этой стадии все еще не заметны. На более поздних стадиях, когда цветок имеет размер примерно 700 мкм, каждый листочек околоцветника несет выраженный придаток, длина которого сопоставима с длиной пластинки листочка. Придаток появляется на абаксиальной стороне листочка. В зрелом бутоне внутренние листочки околоцветника плотно прижаты друг к другу поверхностями, обращенными к центру цветка, но срастания при этом не происходит, и листочки обособляются при распускании цветка. Расположение прижатых друг к другу в бутоне дистальных частей внутренних листочков симметричное, то есть перекрывания не наблюдается, и расположение может быть описано как створчатое.
Развитие цветка Thismia javanica (Nuraliev et al., submitted, Fig. 17-20) протекает со следующими особенностями. Соцветие состоит из нескольких цветков, и именно до четырех и, возможно, более. Листочки наружного и внутреннего кругов околоцветника изначально не отличаются по размеру и форме. Гетероморфность листочков становится заметна, когда цветок достигает размера 300 мкм. На этой стадии наружные листочки явно налегают краями на внутренние и имеют более или менее уплощенную форму. Внутренние листочки, напротив, имеют выраженный придатокв виде массивного выроста в апикально-абаксиальной части. В ходе последующего развития придатки станосятся длиннее, и в течение значительного времени они сохраняют большую толщину: когда цветок практически достигает 1 мм в диаметре, толщина придатков составляет примерно половину ширины листочка. На поздний стадиях, при диаметре цветка около 1.5 мм, три придатка отклоняются в одном и том же направлении (по или против часовой стрелки), что придает внутреннему кругу околоцветника скрученный облик. Такое отклонение от актиноморфного плана строения цветка может рассматриваться как способ упаковки придатков, когда они достигают значительной длины. Пластинки листочков внутреннего круга остаются относительно небольшими в течение раннего развития придатков, и представляют собой узкие края вдоль основания придатка. К моменту достижения цветком диаметра 1 мм, пластинки внутренних листочков формируют контакт друг с другом своими толстыми краями. На поздних стадиях развития цветка пластинки становятся существенно шире, в то время как придатки растут в основном в длину, и лишь слегка в ширину. Когда цветок практически сформирован, внутренная поверхность гипантия становится окончатой: в ней появляются многочисленные небольшие отверстия, ведущие в подобие лабиринта в толще стенки гипантия.
Таким образом, проведенное исследование позволило впервые получить данные о ранних и средних этапах развития цветка для рода Thismia (и для всего семейства Thismiaceae). В частности, впервые установлен порядок заложения кругов цветка и показано, что он отличается от акропетального: после одновременного заложения листочков околоцветника появляются плодолистики, и лишь затем - тычинки. Такой порядок заложения является редким среди покрытосеменных в целом. В ходе развития гинецея сначала появляется асимпликатная зона (то есть свободные стилодии), затем симпликатная. Синасцидиатная зона у изученных нами видов полностью отсутствует, но в работе Rübsamen (1986, t. 15k) изображена короткая синасцидиатная зона у T. rodwayi.
Наши исследования показывают, что чешуи обертки у Thismia являются приближенными к цветку стеблевыми листьями. В некоторых случаях они прикреплены на несколько разных уровнях, и это дает возможность определить, что их филлотаксис продолжает спираль остальных листьев. Аннулюс морфологически является результатом конгенитального срастания оснований тычиночных нитей, и околоцветник не принимает участия в его образовании. Придатки листочков околоцветника гомологичны у изученных видов, включая такие контрастные случаи, как T. javanica (а также T. annamensis) и T. mucronata: их расположение и начальные этапы развития являются крайне сходными. Хотя внешне придатки у всех видов кажутся абаксиальными выростами пластинок листочков, и листочки с придатками и без имеют одинаковый облик пластинок (как в пределах одного вида, так и между разными видами), васкулатура свидетельствует в пользу того, что листочки представляют собой верхушки листьев.
У всех изученных нами видов завязь является одногнездной и содержит три колончатые плаценты, прикрепленные ко дну завязи и к ее крыше. Хотя плацентация Thismia часто описывается как центральная, она отличается от таковой у растений с истинно центральной плацентацией: у последних плаценты прикрепляются только в основании, но не на верхушке, и несут ненарушенную первичную морфологическую поверхность. Колончатые плаценты, напротив, не могут появиться в ходе развития без явлений постгенитального срастания или разрыва. Наши исследования показали, что у Thismia имеет место разрыв тканей. Такая плацентация может быть описана как изначально париетальная, напоминающая центральную из нескольких отдельных плацент. Насколько нам известно, такой тип плаценты не зарегистрирован ни в одном другом семействе покрытосеменных.
Изучение соцветий показало, что виды отличаются по числу цветочных предлистьев (= листочков обертки у боковых цветков): у T. annamensis их три, у T. javanica два, у T. mucronata бывает два и три. Также отличается плоскость ветвления, в связи с чем у T. annamensis соцветие - дрепаниум, а у остальных двух видов - бострикс (Nuraliev et al., submitted, Fig. 1).
По результатам морфологической и морфогенетической части проекта подготовлена рукопись статьи, которая подана в журнал Botanical Journal of the Linnean Society (Nuraliev et al., submitted).
5. Изучение пыльцы Thismia.
На световом и сканирующем электронном микроскопе (Рис. 1) была исследована пыльца двух видов, T. puberula и T. javanica. Она относится к тому же палиноморфологическому типу, что и виды, исследованные на первом этапе работы. Пыльцевые зерна всех исследованных видов Thismia плоско-выпуклые с одной очень мелкой порой и слабо выраженной скульптурой.
Thismia puberula (исследованный образец: Yudina, Nuraliev 15, собранный в ходе поездки по проекту): пыльцевые зерна однопоровые, плоско-выпуклые. Длина большего диаметра (16,8) 17,9 (19,4) мкм, длина меньшего диаметра – (12,6) 13,1 (14,0) мкм. Пора округлая, (1,36) 1,9 (2,43) мкм диаметром, положение поры неясное, предположительно – экваториальное. Экзина покровная, (0,56) 0,7 (0,8) мкм толщиной, слоистость не видна. Поверхность экзины в СЭМ гладкая с мелкими перфорациями, диаметр самых крупных перфораций не превышает 0,1 мкм.
Thismia javanica (исследованный образец: Do Thi Xuyen 800): пыльцевые зерна однопоровые, плоско-выпуклые. Длина большего диаметра (13,9) 15,2 (16,5) мкм, длина меньшего диаметра – (9,8) 10,4 (10,8) мкм. Пора округлая, (1,29) 1,45 (1,92) мкм диаметром, положение поры неясное, предположительно – экваториальное. Экзина покровная, (0,47) 0,65 (0,89) мкм толщиной, слоистость не видна. Поверхность экзины в СЭМ гладкая с редкими мелкими ямками, диаметр которых не превышает 0,1 мкм.
Исследованный нами образец T. javanica по морфологии пыльцы существенно отличается от описания Caddick et al. (1998), где для этого вида описана поверхность с многочисленными крупными перфорациями, образующими на поверхности сетку.
Согласно данным Caddick et al. (1998), для Thismia характерен сукцессивный тип микроспорогенеза и квадратные тетрады. Зрелые пыльцевые зерна Thismia имеют плоско-выпуклую форму, напоминающую дольку апельсина, при этом пора расположена на одном из концов «дольки». На микрографиях поздней тетрадной стадии T. mucronata хорошо видно, что микроспоры, окруженные толстой каллозной оболочкой, ориентированы в тетраде плоскими сторонами друг к другу, при этом апертура расположена на дистальной полусфере, но не занимает полярного положение. Такое положение апертуры в квадратной тетраде ранее никем не было описано среди покрытосеменных растений. Смещение единственной апертуры с дистального полюса отмечено у злаков, однако положение апертуры злаков строго не определено и, как правило, она рассматривается как дистальная (улькус). Возможно, смещение апертуры у злаков с дистального полюса связано со специфическим периферическим расположением тетрад и зрелых пыльцевых зерен в полости пыльника, при котором апертура каждого пыльцевого зерна в процессе развития контактирует с клетками тапетума (Christensen & Horner, 1974; Kirpes et al., 1996).
Структура оболочки пыльцевых зерен Thismia была изучена у T. mucronata, T. puberula и T. annamensis при помощи трансмиссионной электронной микроскопии (Рис. 2). Зрелая спородерма T. mucronata на стадии двухклеточного пыльцевого зерна состоит из экзины и интины. Экзина представлена эктэкзиной, состоящей из толстого гомогенного покрова с редкими сквозными перфорациями, редких столбиков и хорошо выраженного сплошного подстилающего слоя. Эндэкзина не развита. Интина во внеапертурной области гомогенная, однослойная. В области апертуры эктэкзина утоньшается, но не исчезает полностью – поверхность поры перекрыта тонким электронно-плотным слоем. Интина значительно утолщается не только непосредственно под порой, но и вокруг нее, и становится отчетливо двухслойной. Внутренний слой интины гомогенный, сходен по структуре и электронной плотности с интиной внеапертурных областей; наружный слой интины рыхлый, гетерогенный, рыхло-гранулярный. Структура зрелой спородермы T. puberula и T. annamensis сходна с таковой T. mucronata. Мощное утолщение интины в области апертуры (онкус) встречается в разных группах высших растений. Оно описано в семействах крапивные (Urtica, Parietaria), березовые (Betula, Carpinus, Corylus), мальвовые (Tilia) и представляет собой линзовидное утолщение интины под апертурой, как правило двухслойное. Среди однодольных растений онкус ранее описан не был, хотя на световых фотографиях пыльцы Thismia в работе Caddick et al. (1998) он отчетливо заметен. У однодольных мощное утолщение интины характерно для безапертурных энтомофильных (Iridaceae, Furness, Rudal, 1999; Zingiberaceae, Kress, Stone, 1982) или гипгидрофильных видов. У энтомофильных видов экзина прерывистая, представленная часто одними шипами. Интина у таких видов не схожа с интиной Thismia - она начинает закладываться очень рано, в зрелом пыльцевом зерне двухслойная, наружный толстый слой пронизан многочисленными каналами. У имбирных пыльцевые зерна такой структуры рассматриваются как проявление неотении (Kress, Stone, 1982).
Нами был поставлен эксперимент по прорастанию пыльцевых зерен Thismia mucronata in vitro, однако добиться их прорастания не удалось. Тест на фертильность, проведенный ацетокарминовым методом, показал, что краситель проникает внутрь пыльцевого зерна очень плохо. После нагревания с ацетокармином протопласты вегетативной и генеративной клеток пыльцевого зерна не прокрашиваются, при этом обе клетки и их ядра хорошо визуализируются. Частичное проникновение красителя наблюдалось лишь спустя 12 часов после нагревания. По-видимому, сплошной тектум без перфораций, очень мелкая пора, перекрытая тонким, электронно-плотным слоем препятствуют проникновению растворов внутрь клетки, что ставит под сомнения вопрос о возможности образования пыльцевой трубки.
6. Репродуктивная биология Thismia.
В ходе поездки по проекту во Вьетнам были проведены наблюдения за динамикой цветения и посещением цветков двух видов Thismia: T. mucronata и T. puberula.
Бутон T. mucronata появляется над поверхностью лесной подстилки, будучи закрыт чешуями обертки. Примерно через трое суток бутон высвобождается из чешуй и продолжает увеличиваться в размере в течение еще около трех дней. Далее цветок открывается постепенно в течение суток. Процесс открывания цветка состоит из двух параллельных событий: листочки наружного круга околоцветника плавно расходятся и постепенно отгибаются наружу, в то же время листочки внутреннего круга околоцветника (образующие митру) слегка удлиняются и приподнимают крышу митры над отверстием, которое служит входом в цветок. Момент, когда вход в камеру цветка становится свободен, можно считать началом цветения. К этому моменту пыльники внутри цветка находятся во вскрытом состоянии. Открывающийся цветок имеет размеры около 10 мм в длину и 5 мм в ширину. В последующие 3-4 дня цветок увеличивается в размерах примерно в два раза. На Рисунке 3(а) цветок 1, находящийся в процессе открывания, примерно в двое меньше, чем цветок 3, достигший окончательных размеров. Далее на Рисунке 3(б) видно, что через трое суток размер молодого цветка практически сравнялся с размерами цветка 3, тогда как последний не изменился ни внешне, ни в размерах. Также в течение 3-4 суток после открывания цветка основания листочков внутреннего круга околоцветника продолжают значительно удлиняться, все выше приподнимая крышу митры над аннулюсом (то есть над входом в цветок). Процесс удлинения листочков околоцветника изображен на Рисунке 3 (в, г, д) и (е, ж, з): темный участок свободных лопастей околоцветника увеличивается в длину примерно в 3-4 раза, тогда как общая форма митры не изменяется. Через 3-4 дня после открывания цветок достигает своих окончательных размеров и продолжает цвести в течение как минимум 5 дней. В изученной нами популяции над поверхностью лесной подстилки одновременно цветет цветков несколько близко расположенных цветков. Точную продолжительность цветения отдельного цветка T. mucronata установить не удалось. Вероятно, она составляет более 10 дней, т.к. наблюдения за цветущим растением T. puberula в течение 10 дней не выявило никаких изменений в открытом цветке, достигшем своих окончательных размеров.
Наблюдения за цветением данных двух видов Thismia показало, что цветки посещаются с 6:00 до 20:00 (то есть в основном в течение светового дня), преимущественно насекомыми из отрядов двукрылые (Diptera) и перепончатокрылые (Hymenoptera) (Таблица 1, 2). Следует отметить, что в период наблюдения посещения цветков были очень редкими и немногочисленными. В то же время, на цветках было замечено значительное число мельчайших беспозвоночных, таксономическую принадлежность которых установить не удалось. Несмотря на их обилие, участие данных беспозвоночных в процессе опыления сомнительно, так как они слишком малы, чтобы переносить достаточное количество пыльцевых зерен на значительное расстояние. Двукрылые (а именно, грибные комарики из семейства Sciaridae) были отмечены ранее в качестве потенциальных опылителей Thismia (Guo et al., 2019). В результате наших наблюдений на цветках также были отмечены грибные комарики (Mycetophyllidae), однако пыльцевые зерна Thismia были обнаружены только на теле мух (Muscomorpha) и перепончатокрылых (Таблица 3, 4). Возможно, малочисленность наблюдаемых нами посещений связана с погодными условиями; также следует отметить, что наблюдения проводились в начале массового цветения популяции, тогда как согласно данным о динамике функционирования цветка цветение популяции должно быть продолжительным. В связи с этим не удалось исследовать смывы пыльцы со статистически значимого числа посетителей. По данной причине на данном этапе нам не удалось окончательно установить, кто является эффективным опылителем Thismia, и наши выводы носят предварительный характер.
На основе из приведенных выше данных можно сделать заключение, что для изученных видов Thismia характерно биотическое перекрестное опыление, и эффективного массового опылителя следует искать среди двукрылых и перепончатокрылых насекомых.
7. Репродуктивная биология Burmannia disticha (Burmanniaceae).
Burmannia disticha относится к семейству Burmanniaceae из порядка Dioscoreales. Это семейство является близко родственным к Thismiaceae. Ранее репродуктивная биология была изучена у микогетеротрофного представителя этого рода, Burmannia wallichii (Zhang, Saunders, 2000). Мы провели изучение автотрофного вида Burmannia disticha с целью сопоставить филогенетически близкие виды с отличающимся способом органического питания.
Цимозное соцветие B. disticha представляет собой дихазий, каждая из двух ветвей которого является монохазием (извилиной). Соцветие зацветает базипетально: первым открывается терминальный цветок, расположенный на оси первого порядка (главная ось соцветия), далее зацветают цветки боковых ветвей в последовательности, соответствующей порядку ветвления соцветия. Все части цветка, кроме свободных частей листочков околоцветника, ярко-фиолетовые. Лопасти околоцветника перед началом цветения имеют зеленовато-желтую окраску. Далее они становятся ярко-желтыми и раскрываются. Цветок открывается в утренние или дневные часы (вероятно, в зависимости от погодных условий). Отдельный цветок функционирует 3 дня, на 4 сутки появляются признаки старения, лопасти околоцветника приобретают фиолетово-желтый цвет. В последующие дни лопасти околоцветника становятся черными, и остальные части околоцветника также начинают увядать и гнить. В тот же день, когда появляются признаки старения у открытого цветка, на соцветии открывается следующий (по порядку ветвления) цветок. Иногда наблюдается промежуток в 1-2 суток между началом старения предыдущего и открыванием последующего цветка. Таким образом, на одной ветви соцветия только один цветок находится в цветущем состоянии, не пересекаясь по времени цветения с соседним. При этом на всем соцветии одновременно можно встретить не более двух цветков, относящихся к двум ветвям дихазия. Такая динамика функционирования соцветия уменьшает вероятность самоопыления.
Соцветие B. disticha посещаются различными двукрылыми (Diptera), чешуекрылыми (Lepidoptera) и перепончатокрылыми (Hymenoptera) насекомыми. Посещения происходили в светлое время суток в промежуток времени с 6:00 до 17:00. Также в качестве случайных (в том числе и ночных) единичных посетителей отмечены равнокрылые (Orthoptera) и пауки (Arachnidae) (Таблица 5). Из наблюдаемых посетителей чешуекрылые и сетчатокрылые проявляли поведение опылителя. Обе этих группы насекомых обладают хоботками. Прилетая на цветок, насекомые просовывали свой хоботок в отверстие между лопастью рыльца, пыльником и стенкой околоцветника, получая таким образом доступ к нектару, расположенному на дне цветочной камеры (Рисунок 4). Структура цветка B. disticha такова, что хоботок насекомого при таком действии неизбежно касается сначала поверхности рыльца, а далее пыльников, расположенных ниже. Можно сделать вывод, что цветок приспособлен к биотическому опылению именно с помощью насекомых, имеющих длинный хоботок.
Среди посетителей были отмечены и другие насекомые с длинными хоботками: это бабочки из семейств Satyridae, Hesperiidae и Pyralidae (Рисунок 5), а также перепончатокрылые, среди которых шмели (Bombus sp. 1) имели очень длинный хоботок, превышающий длину тела (Рисунок 6). Для оценки возможного вклада данных посетителей в процесс опыления B. disticha был проведен подсчет пыльцевых зерен в смывах с тел пойманных насекомых (Таблица 6). Выяснилось, что пыльцевые зерна Burmannia не переносятся двукрылыми насекомыми, изредка попадаются на телах чешуекрылых и в большом количестве обнаруживаются на теле перепончатокрылых. В частности, наибольшее число пыльцевых зерен (в среднем на одно насекомое) было обнаружено на теле Bombus sp. 1, что явно говорит о серьезном вкладе данных насекомых в процесс опыления. В смывах с тел бабочек было обнаружено небольшое число пыльцевых зерен, что может указывать на их незначительное участие в опылении B. disticha. В целом, чешуекрылые являются распространенными опылителями, их имаго питаются преимущественно нектаром и имеют длинный хоботок – что косвенно соответствует синдрому цветков Burmannia. Следует отметить, что именно у представителей семейства Hesperiidae встречаются самые длинные хоботки среди всех чешуекрылых. Малое количество пыльцы в смывах можно объяснить следующим образом. Пыльцевые зерна прикрепляются только к хоботку насекомого и именно на нем адресно доставляются на рыльце другого цветка. К другим частям тела бабочек пыльца не прикрепляется. Однако относительная поверхность тела у бабочек очень большая, а крылья покрыты чешуйками, которые попадают в смыв при исследовании вместе с пыльцой. Таким образом, образец смыва состоит в основном из чешуек и обнаружение в нем пыльцевых зерен затруднительно.
Учитывая частоту посещений, размеры хоботка, характер поведения на цветке и наличие пыльцы на теле можно сделать вывод, что наиболее эффективными опылителями B. disticha являются перепончатокрылые насекомые, в частности шмели вида Bombus sp. 1.
8. Репродуктивная биология Vietorchis furcata (Orchidaceae).
Vietorchis furcata - редкое микогетеротрофное растение из семейства Orchidaceae, известное по двум популяциям в южном Вьетнаме (Averyanov et al., 2013). В ходе поездки по проекту во Вьетнам были проведены наблюдения за 17 соцветиями V. furcata в момент его массового цветения. Соцветия были помечены индивидуальными этикетками и каждое соцветие фотографировали минимум один раз в сутки. Также были проведены наблюдения за посещением цветков насекомыми. Для этого была применена видеосъемка и также прямые визуальные наблюдения.
Соцветие V. furcata развивается минимум 10 суток с момента появления над поверхностью почвы до формирования первого бутона. Бутон после формирования развивается еще несколько суток до начала цветения. Цветок отрывается постепенно в течении одних суток. Лопасти околоцветника широко раскрываются, освобождая губу, вероятно, служащую в качестве посадочной площадки для насекомого-опылителя. В таком виде цветок остается в течение длительного времени, продолжительность функционирования одного цветка может составлять от 10 до 16 суток и, возможно, более. Цветок остается ярким и не увядает независимо от наличия в нем поллиниев (т.е. даже в случае их искусственного изъятия). Вероятно, такие цветки продолжают привлекать опылителей своим ярким околоцветником, что повышает вероятность посещения соседних цветков соцветия. Соцветие V. furcata у наблюдаемых растений - кисть из 1-3 цветков. Каждый последующий цветок на соцветии открывался через 6-8 суток после предыдущего. Одновременно на соцветии могут находиться до трех функционирующих цветков (Рисунок 7).
В результате длительных (более 10 суток) наблюдений за цветущими соцветиями V. furcata нами не было отмечено посещения цветков насекомыми. Нами зарегистрировано, что у всех наблюдаемых цветков поллинии оставались интактными на протяжении всего наблюдения. Этот факт косвенно подтверждает, что опыление в момент исследования не происходило. Однако у некоторых цветков, начавших гнить в начале исследования, поллинии отсутствовали. Наблюдение за такими отцветшими соцветиями выявили образование на них плодов. Данные факты лишь косвенно говорят в пользу наличия биотического перекрестного опыления у V. furcata, однако не доказывают его, что не позволяет исключать возможность самоопыления у данного вида.
9. Изучение таксономического разнообразия и географического распространения микогетеротрофных растений в тропической Азии.
В ходе обработки материала выявлен и описан новый для науки вид Didymoplexis holochelia (Orchidaceae) - микогетеротрофное растение, обнаруженное М.С. Нуралиевым в ходе экспедиционных работ в Северном Вьетнаме. Этот вид морфологически наиболее близок к D. sirichaii, описанному из северо-западного Таиланда, но отличается от него более высоким стеблем, длинным не утолщенным корневищем, более крупным цветком, светло-коричневым цветом цветка с белой губой, а также размером и формой губы. Приводятся детальные морфологические фотографии и рисунки нового вида. Обобщены сведения о распространении видов рода Didymoplexis в мировом масштабе, показано, что Восточный Индокитай входит в область наибольшего видового разнообразия этого рода. При этом во флоре Вьетнама известно четыре из приблизительно 20-ти видов рода. Более высокое разнообразие зарегистрировано лишь на Суматре (6 видов), в Таиланде и на Борнео (по 5 видов). Результаты изучения рода Didymoplexis опубликованы в виде статьи в международном журнале Phytotaxa (Averyanov et al., 2019).
Осуществлено определение и каталогизация коллекции образцов бесхлорофилльных растений, собранных М.С. Нуралиевым с 2009 по 2018 год в Юго-Восточной Азии. Проделанная работа позволила создать полный список имеющихся образцов из Вьетнама с указанием их географического местонахождения. В этот список вошло паразитическое семейство Balanophoraceae с четырьмя видами и микогетеротрофные виды из шести семейств: Ericaceae (1 вид), Petrosaviaceae (1 вид), Orchidaceae (16 видов), Burmanniaceae (1 вид), Thismiaceae (3 вида) и Triuridaceae (4 вида). Данные образцы депонированы в гербариях MW и LE. Проведен краткий анализ особенностей распространения нефотосинтезирующих растений с учетом высоты над уровнем моря. Выявлены наиболее перспективные направления для дальнейших исследований. Результаты работы опубликованы в виде статьи в международном журнале Wulfenia (Nuraliev et al., 2019).
|
