| Результаты этапа: 1. Иммунофенотипирование клеточных линий
Иммунофенотип клеточных линий оценивали по маркерам CD44/CD90/CD133/CD57/CD24. CD90 использовали в качестве маркера столовых клеток (для нормальных и опухолевых клеток простаты), CD57 – в качестве маркера люминальных клеток, CD44 и CD133 – в качестве маркеров эпителиальных базальных стволовых клеток, и CD24 – в качестве маркера созревания для эпителиальных клеток. Клетки культур PC3 и RWPE-1 доращивали до примерно 50%-го монослоя, снимали трипсином и окрашивали по стандартному протоколу1. Анализ проводили на 6-канальном сортере FACSAria SORP (BD Biosciences, USA). Иммунофенотипирование проводили на каждом пассаже клеток (с 1 по 10), для количественной оценки представленности маркеров использовали оценку медианной интенсивности флуоресценции (MFI) для популяции клеток.
Клетки PC3, по морфологическому фенотипу соответствующие аденокарциноме простаты, и клетки RWPE-1, соответствующие эпителиальным клеткам периферической зоны нормальной простаты, имели похожий фенотип as CD44+/CD90-/CD133-/CD57-/CD24+- на 8 пассаже (Рисунок 1). Средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) для PC3 составили: CD44 MFI = 9489.67±8605.98, CD90 MFI = 172±43.35, CD133 MFI = 101.67±34.59, CD57 MFI = 78.67±12.58, CD24 MFI = 136.50±57.28. Средние значения интенсивности флуоресценции для клеток RWPE-1 составили: CD44 MFI = 9567.67±7871.92, CD90 MFI = 176.33±95.03, CD133 MFI = 137.67±37.63, CD57 MFI = 121.67±32.32, CD24 MFI = 142±50.91.
В работе мы подтвердили, что клеточная линия PC3 имеет фенотип CD44+CD133-CD90-CD57-, описанный в литературе2-5. При этом уровень маркера CD24 меняется в зависимости от пассажа, в целом популяцию клеток PC3 можно назвать частично положительной по CD24. Уровень экспрессии опухолевого маркера CD44 также менялся в зависимости от пассажа. При этом культура условно нормальных клеток простаты RWPE-1 имела сходный фенотип, однако, в отличие от клеток PC3, неуклонно возрастал после 3 пассажа, а с 8 пассажа появилась маленькая субпопуляция клеток, экспрессирующая маркер CD133.
Таким образом, мы впервые описали расширенный иммунофенотип для клеток RWPE-1 и подтвердили литературные данные об иммунофенотипе клеток PC3. Иммунофенотипический статус определяет обе эти культуры как недодифференцированные клетки разной степени зрелости (фенотип от переходного к базальному), при этом уровень экспрессии CD44 в клетках RWPE-1 растет в процессе культивирования и приближается к таковому для клеток PC3 после 4 пассажа (Рисунок 2). Схожесть иммунофенотипов условно нормальных и опухолевых клеток простаты, а также гетерогенность экспрессии маркеров свидетельствует о необходимости поиска дополнительных маркеров туморогенного потенциала клеток простаты.
2. Поиск наиболее стабильных референтных генов для нормализации данных ПЦР в реальном времени в нормальных и опухолевых клетках простаты
Одним из новых специфических маркеров опухолевых клеток простаты является редкая изоформа миозина 1С, описанная нашими зарубежными коллабораторами и названная изоформа А6. повышение уровня экспрессии изоформы А на уровне белка было показано для некоторых клеточных линий рака простаты и для мышиной модели TRAMP (модель рака простаты)7.
Для того, чтобы оценить диагностический потенциал изоформы А миозина 1С, мы детектировали экспрессию этой изоформы на уровне мРНК в линиях рака простаты (LNCaP, 22Rv1, и PC3), линии условно нормальных клеток простаты RWPE-1, контрольных клеточных линиях эпидермоидной карциномы А431 и карциномы легкого А549, а также в линии неопухолевых фибробластов 3Т3 методом ПЦР в реальном времени.
Детекция опухолевых маркеров на уровне мРНК является простым, надежным и широко используемым методом для различных типов опухолевой ткани, однако точность этого метода сильно зависит от выбора референтных контрольных генов, значения экспрессии которых используются для нормализации данных8-10. Известно, что даже в пределах одной ткани и одного типа клеток выбор референтных генов зависит от метода выделения РНК, степени гетерогенности образца, и варианта опухоли11-13, поэтому необходимо проверять стабильность комбинации референтных генов для каждого эксперимента.
Исходя из литературных данных11,13,14, мы выбрали 10 кандидатов в референтные гены для опухолей простаты, информация о генах и последовательностях праймеров для них приведена в Таблице 1. Все ПЦР эксперименты проводились в трипликате, в качестве технического контроля использовали один и тот же образец кДНК в каждой плашке (inter-run calibrator, IRC). Все ампликоны были написаны через экзон для предотвращения амплификации геномной ДНК. Специфичность праймеров доказывали по единственному пику на кривой плавления и по продукту предсказанной длины на 1.5% агарозном гель-электрофорезе. Эффективность амплификации оценивали по формуле E = [10(−1/slope) − 1] с использованием графика линейной регрессии для последовательных разведений кДНК одной из клеточных линий (LNCaP). Условия и протокол ПЦР были описаны нами ранее15. Относительное количество кДНК рассчитывали по формуле Q = E С(q)min-C(q)n, где Е – эффективность амплификации, С(q)n – среднее значение C(q) по трипликату, С(q)min – минимальное значение C(q) в выборке.
Анализ исходных данных показал, что все референтные гены экспрессируются в нормальных и опухолевых клетках простаты, и могут быть разделены на три группы: гены с высоким уровнем экспрессии (HPRT1), гены со средним уровнем экспрессии (ACTB, TBP, YWHAZ, RPL13A, B2M, ALAS1) и гены с низким уровнем экспрессии (UBC, SDHA, GAPDH) (Рисунок 3). Это позволяет оценивать высокий и низкий уровень экспрессии целевого гена в опухолевых и нормальных клетках простаты. Эффективность экспрессии для всех генов-кандидатов варьировала от 0.93 до 1.05, коэффициент корреляции R2 варьировал от 0.992 and 0.999 (Таблица 2). Стабильность экспрессии генов оценивали в программах geNorm (Center of Medical Genetics, Ghent University hospital, geNorm version 3.5, 2002) и NormFinder (Molecular Diagnostic Laboratory, Department of Clinical Biochemistry, Aarhus University Hospital, Дания, 2004).
В программе geNorm ранжирование генов происходит по стабильности уровня их экспрессии (M)9. Все гены кандидаты, указанные выше, имели М ниже предложенного программой порога в 1.5, однако наиболее низкой величина М оказалась для пары YWHAZ/GAPDH (0.52). Кроме того, для генов HPRT1 и ACTB значение М также оказалось меньше 1 (Таблица 3). NormFinder, в отличие от geNorm, оценивает экспрессию каждого гена независимо от других по мере их стабильности SV. Анализ данных в этой прграмме показал, что наиболее стабильным в выборке является ген GAPDH (SV = 0.08), вторым по стабильности является ген HPRT1 (SV = 0.11), и третьим геном является YWHAZ с SV = 0.13 (Таблица 3). Для определения достаточного для корректной нормализации количества референтных генов мы воспользовались анализом коэффициентов парных вариаций в программе geNorm. Наименьшее значение коэффициента парных вариаций во всей выборке было достигнуто для значения V4/V5 (Рисунок 4), то есть добавление четвертого по очереди гена не вносит значительных изменений в фактор нормализации и для корректного расчета экспрессии целевого гена достаточно трех референтных генов.
Таким образом, мы впервые показали, что для корректной оценки данных ПЦР в реальном времени необходимо использовать комбинацию трех (а не двух) референтных генов, и комбинация генов YWHAZ, GAPDH, and HPRT1 позволяет наиболее корректно нормализовать данные ПЦР в реальном времени в нормальных и опухолевых линиях клеток простаты.
3. Оценка уровня экспрессии мРНК изоформы А миозина 1С в нормальных и опухолевых клетках простаты
Проанализировав экспрессию мРНК в клеточных линиях рака простаты (PC3, LNCaP, и 22Rv1) и условно неопухолевых клетках линии RWPE-1, мы подтвердили данные наших зарубежных коллабораторов о повышении уровня экспрессии мРНК изоформы А миозина 1С в опухолевых клетках простаты7,16. По нашим данным, разница в уровне экспрессии мРНК между опухолевыми и неопухолевыми клетками простаты составила два порядка. Медианы для относительного нормализованного количества кДНК опухолевых клеток простаты варьировали от 1.938 (PC3) до 3.426 (22Rv1) по сравнению с 0.037 для клеток RWPE-1 (Рисунок 5). Интересно, что уровень экспрессии изоформы А миозина 1С в клетках андроген-зависимо й линии рака простаты LNCaP оказался в два раза ниже, чем для андроген-независимой линии PC3, что может иметь отношение к патогенезу этой опухоли и требует подтверждения на клиническом биопсийном материале. мРНК изоформы А миозина 1С не экспрессировалась в клетках нормальных фибробластов (линия 3Т3, медиана относительного нормализованного количества кДНК 0.003), и экспрессировалась на очень низком уровне в опухолевых клетках аденокарциномы легкого (линия А549, медиана относительного нормализованного количества кДНК 0.011) и клетках эпидермоидной карциномы (линия А431, медиана относительного нормализованного количества кДНК 0.022) (Таблица 4).
Для определения предела детекции мРНК изоформы А миозина 1С в опухолевых клетках, мы получили смеси опухолевых клеток PC3 и RWPE-1 в соотношении 1:1, 1:3, 1:10. 1:30, 1:100, 1:300 and 1:1000 (где 1 часть соответствует количеству 104 клеток PC-3), и оценили экспрессию мРНК изоформы А методом ПЦР в реальном времени. Относительное нормализованное количество кДНК варьировало от 1.478 (смесь клеток 1:1) до 0.078 (смесь 1:1000) по сравнению с 2.389 для мРНК только PC3 и 0.021 для мРНК только RWPE-1 (Рисунок 6).
Таким образом, мы подтвердили данные зарубежных колабораторов о повышении уровня экспрессии изоформы А миозина 1С в опухолевых клетках рака простаты и впервые показали следующее:
1) Разница в уровне экспрессии мРНК изоформы А миозина 1С между опухолевыми и неопухолевыми клетками составляет два порядка
2) Экспрессия мРНК изоформы А миозина 1С в андроген-зависимой линии рака простаты LNCaP в два раза ниже, чем в андроген-независимых линиях PC3, LNCaP, и 22Rv1, что может иметь важное диагностическое и прогностическое значение
3) Предел детекции опухолевых клеток методом оценки экспрессии мРНК изоформы А миозина 1С составляет 1:1000, что может иметь важное значение для исследования биопсийных образцов с относительно небольшим содержанием опухолевых клеток.
4. Оценка уровня экспрессии белка изоформы А миозина 1С в опухолевых и нормальных клетках простаты
Для оценки специфичности экспрессии изоформы А миозина 1С на уровне белка, мы провели иммуноцитохимическое окрашивание клеток PC3 и клеток RWPE-1, специфическое моноклональное антитело к изоформе А было выделено и предоставлено нашими зарубежными коллабораторами. Клетки окрашивали по стандартному протоколу, разведение первых антител составило 1:150, в качестве вторичных антител использовали мышиные антитела, конъюгированные с красителем Cy2 (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:100, для визуализации ядра образцы докрашивали красителем DAPI, образцы заключали в мовиол. Фиксированные препараты снимали на флуоресцентном микроскопе Nikon TiE с объективом PlanApo 60×/1.4 (фазовый контраст). Изображения записывали с помощью цифровой камеры Hamamatsu ORCA FLASH2, с использованием фильтров для FITC (возбуждение 450-490 нм; эмиссия 510-540 нм) и DAPI (возбуждение 340-380 нм; эмиссия 435-485 нм). Условия съемки и экспозиция были одинаковыми для всех препаратов. Данные анализировали в программе ImageJ (NIH, Bethesda, США). Для оценки значений средней интенсивности флуоресценции на изображении были выбраны маленькие области одинаковой площади в ядре, цитоплазме и за пределами клетки (это значение было далее использовано для коррекции на уровень шума). Финальная обработка изображений проводилась в программе Adobe Photoshop (Adobe Systems, США).
В клетках PC3 мы наблюдали яркое окрашивание изоформы А как в ядре, так и в цитоплазме, в клетках RWPE-1 локализация белка была той же, однако сигнал был значительно слабее Рисунок 7). Такой же слабый сигнал детектировался в клетках аденокарциномы легкого A549 (. Для количественной оценки экспрессии белка мы рассчитали средние интенсивности флуоресценции (MFI) изоформы А в ядре и цитоплазме для 56 клеток RWPE-1 и 58 клеток PC3. Медиана по выборке MFI для ядер клеток PC3 составила 1749.0 по сравнению с 924.9 для клеток RWPE-1 (Рисунок 8) (статистические значимые различия по критерию Манна-Уитни, р<0.0001). Разница в окрашивании цитоплазмы клеток была менее выраженной, медиана для выборки MFI в клетках PC3 была 813.5 по сравнению с 602.1 для клеток RWPE-1 (различия также статистически значимы, p<0.0001). Приблизительная оценка экспрессии белка для иммунофлуоресцетно окрашенных клеток показал, что разница в уровне экспрессии белка для ядер клеток PC3 и RWPE-1 составляет почти 2 раза, тогда как в цитоплазме количество изоформы А в клетках PC3 по сравнению с клетками RWPE-1 больше только в 1.35 раза. Интересно, что соотношение интенсивности флуоресценции ядро/цитоплазма в клетках PC3 составляет 2.14 (1.53 в клетках RWPE-1), что согласуется с данными наших коллабораторов6 о преимущественно ядерной локализации этого белка.
Таким образом, мы доказали специфичность изоформы А миозина 1С как маркёра опухолевых клеток простаты и впервые показали повышение уровня экспрессии этого белка, а также описали локализацию изоформы А в клетках PC3 и RWPE методом флуоресцентного окрашивания. В целом, наши данные согласуются с данными зарубежных партнеров, которые методом вестерн-блота показали 8-и кратное повышение уровня экспрессии изоформы А миозина 1С в опухолевых клетках простаты PC3 по сравнению с нормальными клетками RWPE-1.
5. Оценка везикулярного состава кондиционированной среды от опухолевых клеток для разработки метода индукции опухолевого фенотипа.
Одной из гипотез предложенного проекта была гипотеза об экзосомальной индукции опухолевого фенотипа при инкубировании условно нормальных клеток простаты RWPE-1 в кондиционированной среде от культуры клеток PC3 (клетки PC3 инкубировались без смены среды в течение трех суток). Для проверки этой гипотезы было необходимо сначала отработать протокол выделения и описания микровезикул из кондиционированной среды.
Для визуализации субклеточных микровезикул был разработан следующий протокол:
Равные объемы кондиционированной клетками PC3 и RWPE-1 среды (6 мл) подвергались последовательному дифференциальному центрифугированию.
1) центрифугирование 10 минут при комнатной температуре, 400 g
2) Супернатант переносился в другую пробирку
3) центрифугирование 10 минут при комнатной температуре, 1000 g
4) Супернатант переносился в другую пробирку
5) центрифугирование 40 минут при +4°С, 10000 g.
Супернатант анализировался на проточном сортере FACSAria SORP 1) неокрашенным и 2) окрашенным комбинацией антител anti-CD44-BV421 + anti-CD24-PE (антитела были выбраны, так как обе клеточные линии демонстрируют полную или частичную положительность по данным маркерам: фенотип CD44+/CD24+-).
Запись каждого файла велась в течение 3 минут. Оценка прямого и бокового светорассеяния, а также интенсивностей флуоресценции проводилась на логарифмической шкале. В качестве триггерных были выбраны каналы флуоресцентной детекции BV421 и PE. Пороговые значения в них были выбраны минимальные (200 условных единиц интенсивности сигнала). Так как общим маркером всех клеток является маркер CD44, анализ проводился в первую очередь в канале детекции BV421.
При стандартных настройках усиления в канале BV421 (450 V) – избыточных для детекции везикул с высокими значениями аутофлуоресценции в коротковолновых каналах детекции – сигнал светорассеяния в анализируемых образцах имеет следующий характерный вид (Рисунок 9А). По диагонали направо вверх на графике SSC/FSC отложены крупные фрагменты клеток и мертвые клетки. Левый нижний край диагонали (выделенный регион Р1) соответствует крупным микровезикулам, нижняя зона (выделенный регион Р3) относится к области электронного шума, промежуточная зона (выделенный регион Р2) относится к мелким микровезикулам. Сигналы во всех выделенных областях проходят пороговую отметку при анализе неокрашенных образцов из-за высоких значений аутофлуоресценции субклеточных частиц в данной области спектра и избыточной чувствительности детектора. Напряжение на детекторе было снижено (до 420 V), пока неокрашенный образец кондиционированной среды не приобрел вид (Рисунок 9Б). Регионы Р2 и Р3 перестали содержать события, так как они перестали проходить пороговую отметку интенсивности сигнала. Регион Р1 содержал события, которые в дальнейшем были отложены на двумерном графике BV421 vs PE и использовались для выставления отсечек интенсивности флуоресцентного сигнала (Рисунок 9В).
Далее были проанализированы окрашенные образцы. Анализ проводился при чувствительности детектора BV421 – 420V. Отсечки были выставлены по интенсивности сигнала в регионе Р1 неокрашенного образца. Таким образом, сигналы за пределами отсечек являются специфичными сигналами флуорохромов. События из каждого региона (Р1, Р2 и Р3) были отложены на индивидуальных двумерных графиках BV421 vs PE и анализировались по отдельности
Для кондиционированной среды RWPE1 в регионе Р3 события имеют минимальные интенсивности сигнала, лежащие, в основном, в пределах отсечки. В регионе Р2 события имеют более высокие значения интенсивности сигнала. Больший процент событий положителен по маркеру CD44, меньший – по CD24. Отсутствует область двойных положительных событий. В регионе Р1 события имеют наибольшие значения интенсивности сигнала. Больший процент событий положителен по маркеру CD44, меньший – по CD24. Появляется область двойных положительных событий (Рисунок 10).
Для кондиционированной среды РС3 в регионе Р3 события имеют наиболее низкие интенсивности сигнала, лежащие, в основном, в пределах отсечки. В регионе Р2 события имеют более высокие значения интенсивности сигнала. Больший процент событий положителен по маркеру CD24, меньший – по CD44. Отсутствует область двойных положительных событий. В регионе Р1 события имеют наибольшие значения интенсивности сигнала. Больший процент событий положителен по маркеру CD24, меньший – по CD44. Область двойных положительных событий отсутствует (Рисунок 11).
Таким образом, мы впервые отработали протокол, который позволяет оценить количество и процентный состав субклеточных частиц в кондиционированной культуральной среде от линий опухолевых и условно нормальных клеток простаты.
Таким образом, в проекте мы показали, что изоформа А миозина 1с является надежным маркером опухолевых клеток простаты, а метод ПЦР в реальном времени позволяет детектировать мРНК изоформы А миозина 1С даже в образцах с малым количеством опухолевых клеток. Кроме того, была начата работа по проверке гипотезу индукции опухолевого фенотипа при экзосомальном переносе изоформы А миозина 1С. По результатам проекта опкубликована статья в журнале PeerJ (IF=2.2)
|
