Исследование взаимодействия вирусоподобных частиц на основе потивирусов с иммуногенными пептидами.НИР

Investigation of the interaction of virus-like particles based on potyviruses with immunogenic peptides.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследование взаимодействия вирусоподобных частиц на основе потивирусов с иммуногенными пептидами.
Результаты этапа: В отчетный период были продолжены структурные исследования вирус-специфических белков ряда вирусов растений со спиральной симметрией. Были изучены факторы, определяющие направление процессов агрегации и диссоциации белков. Способность различных добавок (полиэлектролитов, поверхностно-активных веществ и некоторых пептидов) предотвращать агрегацию белков проанализирована. Показано, что белок оболочки (БО) А-вируса картофеля (АВК) образует ассоциаты-кластеры, состоящие из 30 субъединиц, устойчивые в водно-солевом растворе с повышенной ионной силой (рН 10,5, 0,5 М NaCl). Для анализа структуры белка в растворе использовали метод малоуглового рентгеновского рассеяния. Эксперименты по анализу белковых структур были проведены на станции P12 синхротрона PETRA III (DESY, Германия, ЕМBL). Показано, что частицы белка АВК диссоциируют под действием 5 мМ додецилсульфата натрия (ДСН) и не разрушаются в среде декстран сульфатов (15-100 кДа). Мы наблюдали формирование комплексов "БО- ДСН", состоящих из 10-12 мелких частиц, объединенных в комплекс "бусины на ожерелье". Аналогичный эффект ДСН показан для сывороточных альбуминов (бычий и человека). Денатурация молекул БО АВК наступает при концентрации детергента в 7 раз ниже, чем для альбуминов, что подтверждает наличие неупорядоченных сегментов в БО АВК. Спектральные методы показывают сохранение вторичной и потерю третичной структуры комплексов "БО- ДСН". Предложен возможный механизм образования частиц белка за счет взаимодействия неупорядоченных концевых доменов и их трансформации в ß-структуры. Результаты работы опубликованы в журнале Молекулярная биология (Ксенофонтов, Добров и др. 2018). На моделях термической аморфной агрегации белков оболочки АВК и вируса табачной мозаики исследовано влияние пептидных добавок на кинетику этого процесса. Были синтезированы и тестированы ряд коротких иммуномодулирующих и нейропептидов (2-7 a.a.). Кинетика агрегации контролировалась УФ-поглощением (320 нм) на спектрофотометре Hitachi UV-2600 и динамическим рассеянием света на приборе Malvern ZetaSizer Nano ZS . Некоторые пептиды (короткие гидрофобные) эффективно подавляли агрегацию; другие ускоряли этот процесс. Предложен возможный механизм подавления агрегации. Работа была доложена на международном конгрессе (43rd FEBS Congress, Prague; 7–12 July 2018) и опубликована в журнале FEBS Open Bio (Ksenofontov, Dobrov, 2018). В 2018 г. проведены эксперименты по тритиевому мечению амилоидоподобных частиц, полученных термической обработкой препарата вируса, для анализа доступной тритию поверхности надмолекулярной структуры (метод тритиевой планиграфии). Подобраны условия мечения частиц (температура вольфрамовой спирали и замороженной мишени, время реакции, содержание воды в мишени), позволяющие получать достаточные уровни радиоактивности аминокислот, определены условия трипсинолиза и выделения пептидов. Результаты работы доложены на IX Российской конференции с международным участием по радиохимии «Радиохимия 2018» (Санкт-Петербург, 17-21 сентября 2018). Одной из задач проекта на 2018 г. была разработка алгоритма «имитационного эксперимента» для сравнения распределения тритиевой метки при мечении изотропным потоком модельной структуры белка в вирионе с распределением, полученным в реальном эксперименте тритиевого мечения. Осуществлена корректировка модельной структуры БО ХВК по данным тритиевого мечения. Результаты работы доложены на конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии» (Севастополь, 17-21.09.18) и опубликованы в статье (Богачева и др, 2018).
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследование взаимодействия вирусоподобных частиц на основе потивирусов с иммуногенными пептидами.
Результаты этапа: Главная цель проекта - детальное изучение молекулярных основ взаимодействия вирусоподобных частиц (ВПЧ) на основе растительных вирусов с иммуногенными пептидами для создания вакцин нового типа. Были продолжены структурные исследования ВПЧ и вирионов на примерах потивируса - А-вируса картофеля (АВК) и тобамовируса - вируса табачной мозаики (ВТМ). Эксперименты по анализу их структуры малоугловым рентгеновским рассеянием (МУРР) были проведены на синхротроне PETRA III (DESY, Германия, ЕМBL). Известно, что ВПЧ - реполимеры белка оболочки (БО) ВТМ - обладают уникальной амилоидоподобной стабильностью: для ее разборки требуются денатурирующие условия. По данным просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) препараты содержали палочковидные «стопки дисков», длиной 30-80 нм. Структурное моделирование этих частиц было выполнено с использованием элемента кристаллографической модели БО ВТМ (1EI7.PDB). Мы сравнили расчетное рассеяние полученных моделей с экспериментальным на всем измеряемом диапазоне. Показана лучшая корреляция данных МУРР с моделью из повторяющейся центральной пары дисков. Положения максимумов интенсивности на кривых рассеяния могут быть использованы как специфическая характеристика образцов и соотнесены с реальными элементами четвертичной структуры (периодичность структуры ВПЧ, шаг спирали вириона). Впервые структуры с низким разрешением ВПЧ и вирионов ВТМ были охарактеризованы в растворе, в условиях, близких к естественным. Подобные наноразмерные ВПЧ могут рассматриваться как потенциальные платформы для направленной модификации их поверхности иммуногенными пептидами при создании вакцин. Работа доложена на международном конгрессе (44rd FEBS Congress, Krakow; 7–11 July 2019) и опубликована в журнале FEBS Open Bio (Ksenofontov et al, 2019). Другими подобными платформами могут быть амилоидоподобные сферические частицы (АСЧ), полученные термической обработкой вирионов или БО вирусов растений (Atabekov et al, 2011). Для адресной модификации таких платформ необходима информация о составе их поверхности, которая может быть получена методом тритиевой планиграфии. Анализ распределения тритиевой метки в составе вирионов ВТМ и АСЧ, проведенный нами, выявил существенные различия их поверхности. В частицах наблюдали пятикратное возрастание включения метки по сравнению с вирионами в регионах Thr42-Arg46, Val69-Arg71 и Ile93-Arg134. Выраженное снижение включения метки (в 4 раза) обнаружили на участки цепи Gly135–Thr158. Два участка из примерно тридцати аминокислот, вероятно, составляют поверхность АСЧ: Arg41-Arg71 (≈26% от общей метки) и Ile93-Arg122 (≈36%). Для характеристики поверхности АСЧ и вирионов использовали также независимый экспериментальный подход - ограниченный протеолиз с масс-спектрометрическим (MALDI-TOF) анализом образующихся пептидов. Трипсин расщеплял сильно меченые сегменты в первые 2–5 мин, что подтверждает их поверхностное расположение. Эти данные открывают новые возможности для направленного присоединения биологически активных групп к поверхности АСЧ. Работа была опубликована в статье журнала PLOS ONE (Ksenofontov et al, 2019). С помощью полученных от наших коллег из Эстонского университета (ТТУ) рекомбинантных плазмид, содержащих БО АВК, на основе тобамовирусного вектора была создана конструкция pCambia-ВПЖТ-БО АВК для максимального накопления целевого белка (Скурат и др.,2014). Полученные химерные вирионы охарактеризованы ПЭМ, электрофорезом в геле и масс-спектрометрией и будут использованы в проекте. За отчетный период выполнено предсказание эволюционно консервативных, иммуногенных и протективных пептидов гемагглютинина вируса гриппа. Два перспективных пептида, длиной 20 и 25 остатков (K39-58 и G23-47), НА2 цепи вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 синтезированы твердофазным методом, очищены ВЭЖХ и их структура подтверждена аминокислотным анализом и масс-спектрометрией. Начата работа по анализу их вторичной структуры и определению их иммуногенности для последующей конъюгации к различным платформам из растительных вирусов. Продолжена разработка алгоритма и тестирование программы определения ориентации и структуры белка оболочки в составе спиральных вирионов и ВПЧ по данным «имитационных экспериментов» мечения изотропным потоком модельных структур и сравнения с тритиевым мечением. Материалы доложены на 2-х Российских симпозиумах.
3 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Исследование взаимодействия вирусоподобных частиц на основе потивирусов с иммуногенными пептидами.
Результаты этапа: На протяжении 2018-2020 годов наш коллектив проводил исследования особенностей строения и структурных перестроек вирионов и вирусоподобных частиц, поти- и тобамо- вирусов растений, с целью их использования в качестве платформ для иммуногенных пептидов гемагглютинина вируса гриппа. Впервые охарактеризована структура и проведено моделирование полимеров белка оболочки (БО) ВТМ, сформированных в «стопки дисков», представляющих интригующий объект из за их амилоидоподобной стабильности. Структурный анализ проведен с использованием метода синхротронного малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Структурное моделирование этих частиц с использованием элемента кристаллографической модели четырехслойного агрегата PDB: 1EI7показало что модели «стопок дисков» представляли собой полые цилиндры. Лучшая корреляция данных эксперимента была достигнута с моделью из повторяющейся центральной пары дисков. Методом тритиевой планиграфии исследован состав поверхности наночастиц, получаемых при термической диссоциации вирионов ВТМ. Анализ распределения тритиевой метки в белке оболочки из интактных вирионов ВТМ и в белке из сферических наночастиц, выявил существенные различия в составе их поверхности. Обнаруженные поверхностные участки подтверждены ограниченным протеолизом с последующим масс-спектрометрическим анализом. Знание поверхностно локализованных аминокислот открывает пути для направленного присоединения биологически активных групп к поверхности таких частиц. Продолжено изучение строения и свойств интактных вирионов А-вируса картофеля (АВК) с помощью SAXS и комплементарных методов. Белки оболочки интактных вирионов АВК содержат поверхностно локализованными частично неупорядоченные N-концевые домены. Показано, что при удалении 32-х N-концевых аминокислот в белке вирион остается компактным, но изменяется шаг спиральной упаковки белковой оболочки. Для характеристики спиральных структур и определения природы этих изменений применили и тестировали новый алгоритм интерпретации данных SAXS. В результате впервые получена структура низкого разрешения нитевидного АВК в растворе, в условиях, близких к естественным. Данные ПЭМ и SAXS показали, что вирионы без N-концевых доменов представляли собой преимущественно палочковидные частицы, в отличие от гибких частиц, характерных для интактного вируса Исследовано строение вирусоподобных частиц БО АВК, и обнаружены ассоциаты-кластеры, состоящие из 30 субъединиц белка, устойчивые в водно-солевом растворе с повышенной ионной силой (рН 10,5; 0,5 М NaCl). Изучены факторы, определяющие направление процессов агрегации и диссоциации белков. Мы изучили влияние декстран сульфатов, а также анионного ПАВ додецилсульфата натрия (ДСН) на структуру и форму ассоциатов АВК. Показано, что под действием ДСН частицы диссоциируют до субъединиц с образованием комплексов “БО-ДСН”, состоящих из 10-12 мицелл ДСН на гидрофобных участках белков, связанных как “бусины на нити” при сохранении элементов их вторичной структуры. Ряд коротких синтетических пептидов (2-7 а.о.) тестировали на возможность подавления модельной агрегации белков. Некоторые пептиды (короткие гидрофобные) эффективно подавляли агрегацию; другие - ускоряли этот процесс. Предложен возможный механизм образования ассоциатов белка за счет взаимодействия неупорядоченных концевых доменов и их трансформации в бета -структуры. Получен агробактериальный вектор, эспрессирующий копию АВК штамма B11 в плазмиде pCambia 1300. В начало гена БО АВК добавлены два сайта рестрикции, по которым можно вставлять последовательности, кодирующие пептиды-антигены ГА вируса гриппа, для создания химерных вирионов и вирусоподобных частиц с экспонированными наружу иммуногенами. Проведено предсказание эволюционно консервативных, потенциально иммуногенных участков гемагглютинина (ГА) вируса гриппа. Синтезирован перспективный пептид-антиген, длиной 20 а.о., из малой цепи ГА вируса гриппа и охарактеризована его первичная и вторичная структуры. Получены и тестированы мышиные сыворотки. Проведен анализ специфичности связывания данного пептида с иммунными сыворотками к вирусам гриппа различных подтипов ГА. Мы полагаем, что аналоги изученного пептида достаточно перспективны для включения их в N-концевые домены БО химерного вириона АВК или модификации поверхности других изученных нами платформ из растительных вирусов. Понимание особенностей структуры и свойств изученных вирионов и вирусоподобных частиц позволило нам продвинуться в понимании молекулярных основ их направленного взаимодействия с пептидами -антигенами с целью получения высокоэффективных вакцин.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".