![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Растительные вирусы, в настоящий момент довольно хорошо охарактеризованы. С момента открытия вируса табачной мозаики вирусы растений являются объектом пристального изучения как со стороны фитопатологов, так и со стороны молекулярных биологов. Так, за изучение вируса табачной мозаики в 20 веке, было получено две нобелевские премии, и этот вирус надолго стал излюбленным модельным объектом со стороны молекулярных биологов. Последнее время снова стал разгораться интерес к растительным вирусам, как к модельным объектам для изучения процессов фитоиммунитета. Так, именно на растительных вирусах был впервые охарактеризован процесс РНК-интерференции (Covey et al.,1997;.Ratcliff et al.,1997) и подробно изучены механизмы гиперчувствительного ответа (Wright et al., 2000). В настоящий момент растительные вирусы являются модельными объектами при изучении ETI и новых типов защитных ответов, в которые вовлечено ядро и субъядерные органеллы растительной клетки (Taliansky et al., 2010). В связи с тем, что тематика изучения механизмов фитоиммунитета является актуальной, кажется интересным изучить те случаи вирусной инфекции, которые протекают в растениях латентно. В настоящий момент имеется два варианта, объясняющих латентный характер протекания инфекции: ослабление инфекционности вируса вследствие мутаций в его геноме и эффективная работа систем антивирусной защиты растения. Первый вариант, обычно, менее распространен, поскольку ослабление инфекционных свойств вируса часто приводит к абортивным инфекциям и элиминации вирусов, тогда как второй вариант довольно часто встречается в природе. До появления методов глубокого секвенирования, выявление вирусов, несущих латентный характер инфекции, было нетривиальной, а порой и неразрешимой задачей. Однако, теперь, благодаря технологиям секвенирования нового поколения появилась возможность определить все возможные варианты транслирующихся внутри растительной клетки РНК, что делает возможным детекцию вирусов, не имеющих четко выраженных симптомов. Одной из групп растений, для которых отсутствуют литературные данные о наличии у них вирусов, являются хвойные. Учитывая тот факт, что вирусы распространены среди самых разнообразных групп живых организмов, было бы логичным предположить наличие у хвойных эффективных способов противостоять вирусным инфекциям. В связи с вышесказанным, данный проект планируется сосредоточить на решении двух основных задач: поиске новых вирусов растений в популяциях ели европейской (Picea abies) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris) и изучению механизмов устойчивости хвойных к вирусным инфекциям. Для решения первой задачи планируется провести глубокое секвенирование большого числа образцов вирусной РНК (через получение кДНК) хвойных, указанных выше видов. Для изучения механизмов устойчивости хвойных к вирусным инфекциям, планируется разработать методику заражения модельными растительными вирусами (вирус табачной мозаики, вирус погремковости табака, вирус штриховатой мозаики ячменя и Х вирус картофеля), охарактеризовать характер протекания вирусной инфекции, изучить конкретные молекулярные пути, задействованные в иммунном ответе хвойных на проникновение патогена, с помощью современных методов вирусологии, молекулярной биологии и протеомики.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 20 апреля 2015 г.-15 декабря 2015 г. | Изучение разнообразия вирусов и вирусоподобных генетических элементов хвойных растений: поиск механизмов, обеспечивающих латентный характер инфекции. |
Результаты этапа: В ходе проекта российским коллективом в 2015 году будут решаться следующие задачи. 1. Выделение фракции двунитевой РНК из образцов потенциально зараженных хвойных растений и получение кДНК библиотек для дальнейшего секвенирования. Для этого образцы хвойного растения будут гомогенизированы. Затем нуклеиновые кислоты из гомогенизированных образцов будут экстрагированы с помощью буферного раствора, содержащего Трис-HCl, ЭДТА, SDS, бета-меркаптоэтанол и поливинилполипирролидон. Полученная суспензия будет отцентрифугирована, а супернатант отобран и после добавления этанола (до конечной концентрации 20%) перенесен на колонки, содержащие CF-11 целлюлозу. Затем целлюлоза промывается специальными растворами для экстракции ДНК и оцРНК, а после с помощью элюирующего буфера, содержащего NaCl и ЭДТА. Полученная фракция двунитевой РНК будет нормализована и станет матрицей для ПЦР с использованием обратной транскрипции. На основе, полученной таким образом нормализованной кДНК, будут созданы библиотеки, которые будут анализироваться с помощью методов высокопроизводительного секвенирования нового поколения. 2. Изучение проявлений инфекционных свойств модельных вирусов на молодых хвойных культурах. В качестве хвойных культур для исследования проявлений инфекционных свойств модельных вирусами планируется использовать молодые растения ели европейской (Picea abies) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris). Эти растения будут заражены следующими модельными РНК-содержащими вирусами из разных систематических групп, а именно представителями семейства Virgaviridae: вирусом табачной мозаики (ВТМ, род Tobamovirus) , вирусом погремковости табака (ВПТ, род Tobravirus), вирусом штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ, род Hordeivirus) и представителем семейства Alphaflexiviridae Х-вирусом картофеля (ХВК, род Potexvirus). Вышеупомянутые вирусы имеют разное систематическое положение, разную инфекционность и разный спектр хозяев. Идентификация вирусов будет проводиться с помощью методов ПЦР, ПЦР в реальном времени, иммуноферментного анализа и вестерн-блоттинга, причем детектироваться вирусы будут как в образцах из инокулированных частей растения, так и в образцах из первично незараженных участков хвойных. Все это позволит оценить чувствительность хвойных растений к различным РНК-вирусам и охарактеризовать процесс протекания вирусной инфекции для целого ряда растительных вирусов. | ||
2 | 1 марта 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение специфических антивирусных механизмов защиты хвойных растений |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".