|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Процессинг и структурно-функциональная характеристика рекомбинантного катепсина L Tribolium castaneumтезисы доклада
- Авторы: Климова М.А., Воротникова Е.А., Терещенкова В.Ф.
- Сборник: Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2015»
- Редакторы: Андреев А.И., Андриянов Андрей Владимирович, Антипов Евгений Александрович
- Тезисы
- Глава в коллективной монографии
- Год издания: 2015
- Издательство: ООО "МАКС Пресс"
- Местоположение издательства: Москва
- Аннотация: Катепсины – ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз пептидной связи. Впервые они были выявлены в лизосомах животных и человека. Цистеиновые катепсины получили свое название благодаря наличию каталитически важного остатка Cys в активном центре и осуществляют неселективную лизосомальную деградацию, принимают участие в активации проферментов, созревании гормонов, а также являются маркерами различных заболеваний, таких как остеопороз, ревматоидный артрит, атеросклероз, метастазирование и инвазия раковых опухолей. Особую группу представляют цистеиновые катепсины, выполняющие пищеварительную функцию у некоторых групп насекомых, в число которых входит малый булавоусый хрущак Tribolium castaneum. Главной пищеварительной пептидазой этого насекомого является катепсин L из семейства папаина С1. Нативный фермент обладает крайне низкой стабильностью, поэтому исследование рекомбинантного катепсина L T. castaneum является актуальной задачей. В работе использован очищенный рекомбинантный фермент, экспрессированный в Pichia pastoris с использованием вектора pPICZalpha A. Рекомбинантная плазмида была изменена таким образом, что синтезированный белок не содержал His-tag, способный повлиять на протеолитическую активность продукта. В связи с этим необходимо было подобрать оптимальные условия выделения и очистки рекомбинантного белка из культуральной жидкости. Использовали два метода: ступенчатое высаливание сульфатом аммония и концентрирование на ячейке Amicon, при этом наиболее оптимальным оказалось концентрирование препарата на ячейке с последующей отмывкой от низкомолекулярных примесей. Катепсин L был экспрессирован в виде неактивного профермента, поэтому автокаталитический процессинг прокатепсина L исследован подробно in vitro: подобраны оптимальные условия протекания эффективного процессинга, такие как время инкубирования и рН среды, а также изучено влияние сульфата декстрана на скорость процесса. Показано, что автокаталитический процессинг прокатепсина L проходит только в кислой среде. Для зрелого фермента изучены электрофоретическая подвижность в нативных и денатурирующих условиях, зависимость активности и стабильности от рН, проведены масс-спектрометрический и ингибиторный анализы, охарактеризована субстратная специфичность,. Предполагается сравнительный анализ пищеварительного катепсина L T. castaneum с другими цистеиновыми катепсинами, такими как лизосомальные катепсины L и B млекопитающих. Работа проводилась при поддержке грантов РФФИ № 14-04-91167-NSFC_a и 15-04-08689-а.
- Добавил в систему: Терещенкова Валерия Феликсовна