Молекулярные механизмы участия урокиназной системы в канцерогенезе, метастазировании и эпителиально-мезенхимальном переходе

Семина, Е.В.; Шмакова, А.А.; Рубина, К.А.; Рысенкова, К.Д.; Климович, П.С.; Горбунова, А.С.; Ткачук, В.А.

Авторы: Семина Е.В., Шмакова А.А., Рубина К.А., Рысенкова К.Д., Климович П.С., Горбунова Анна С., Ткачук В.А.
Журнал: Злокачественные опухоли
Том: 9
Номер: 3s1
Год издания: 2019
Первая страница: 130
Последняя страница: 131
DOI: 10.18027/2224-5057
Аннотация: Цель. Активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа uPA) и ее рецептор (uPAR) являются частью системы активаторов плазминогена, которая играет важную роль в процессах опухолевого роста и метастазирования за счёт ее участия в ремоделировании внеклеточного матрикса, включая разрушение базальной мембраны и активации депонированных в матриксе факторов роста и цитокинов. Связывая урокиназу, uPAR локализует uPA-зависимый протеолиз на лидирующем крае мигрирующих опухолевых клеток, обеспечивая векторность процессов миграции и инвазии. Помимо этого, uPA/uPAR активирует внутриклеточную сигнализацию с участием митоген-зависимых протеинкиназ Ras-Raf-MEK-ERK, которая дополнительно стимулирует пролиферацию, адгезию, миграцию и метастазирование. Появляются также данные о том, что uPAR вовлечен в регуляцию эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП) в опухолевых клетках, который необходим для инвазии и метастазирования. Предполагается, что uPA/uPAR система опосредует ЭМП независимо от протеазной активности урокиназы, возможно, за счёт участия uPAR в активации внутриклеточной сигнализации. Известно, что экспрессия uPA и uPAR повышена при различных типах злокачественных новообразований. Высокий уровень uPA и uPAR характерен для опухолей с высоким метастатическим потенциалом и коррелирует с неблагоприятным клиническим прогнозом, что позволяет рассматривать урокиназную систему как новую перспективную терапевтическую мишень для лечения онкологических заболеваний. Несмотря на довольно значительный эффект ингибиторов uPA/uPAR, снижающих скорость опухолевого роста в экспериментальных условиях in vivo и in vitro, в клинике такие подходы не привели к желаемому терапевтическому эффекту. Более того, часть экспериментальных работ свидетельствует об обратном: подавление активности uPA и uPAR может стимулировать опухолевую прогрессию. Таким образом, целью работы являлось выявление клеточных и молекулярных механизмов участия урокиназной системы в процессах регуляции пролиферации, ЭМП, миграции и инвазии опухолевых клеток, которое позволили бы выявить новые ключевые мишени для терапевтического воздействия. Материалы и методы. В работе были использованы линейные клетки нейробластомы мыши Neuro2a. Для подавления экспрессии гена рецептора урокиназы uPAR использовали технологию редактирования генома CRISPR/Cas9; для гиперэкспрессии uPAR и ре-экспрессии в клонах, не экспрессирующих uPAR, использовали плазмидную конструкцию, содержащую кДНК рецептора урокиназы мыши. Для оценки экспрессии белков использовали методы полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вестерн блота, проточной цитофлуориметрии и иммунофлуоресцентного окрашивания клеток в сочетании с конфокальной микроскопией. Миграцию клеток анализировали с использованием метода царапины на монослое (wound scratch assay), клеточный индекс – с использованием прижизненной системы IncuCyte. Влияние урокиназного рецептора на развитие химиорезистенности опухолевых клеток оценивали после инкубации клеток в присутствии 30 μM цисплатина в течение 24 часа. Для количественной оценки активности каспазы-3 использовали тест-систему, основанную на реакции со специфическим субстратом. Непарные t-тесты Student использовались для сравнения данных между двумя группами. Множественные сравнения проводили с использованием ANOVA, post hoc тест Tukey. Критический уровень значимости принимали равным р < 0.05. Результаты. Мы показали, что использование технологии CRISPR/Cas9 для выключения экспрессии гена uPAR в клетках нейробластомы мыши Neuro2a приводит к значительному (на 60%, p <0,05) снижению пролиферации клеток и уменьшению экспрессию основного маркера пролиферации клеток - Ki-67. В клетках с нокаутированным uPAR, активируется каспаза-3 и накапливается низкомолекулярная форма белка PARP-1, свидетельствующая о деградации ДНК и гибели клеток по механизму апоптоза. Мы обнаружили, что экспрессия uPAR вызывает значительные изменения морфологии клеток: нокаут uPAR приводит к достоверному увеличению среднего размера клеток, тогда как гиперэкспрессия uPAR - к противоположному эффекту. Мы впервые показали, что нокаут uPAR в клетках нейробластомы индуцирует в них ЭМП переход, увеличивает миграцию, подавляет экспрессию эпителиальных маркеров (E-кадгерина, окклюдина и кладудина-5) и активирует экспрессию мезенхимных маркеров (N-кадгерина, интерлейкина-6 и α-SMA). При этом подавление экспрессии uPAR сопровождается изменением внутриклеточной сигнализации с участием киназы Erk1/2, активацией миграции и снижением способности клеток формировать эпителиальные колонии, т.е., приводит к утрате эпителиального фенотипа. Поиск молекулярного механизма выявил урокиназу в качестве ключевого регулятора этих процессов: отсутствие uPAR на мембране клеток нейробластомы приводит к транслокации урокиназы в ядро и активации транскрипционных факторов ЭМП-программы - NF-kβ и Snail. При этом изменение экспрессии uPAR не влияет на маркеры стволовости в Neuro2a клетках – нокаут uPAR никак не отражался на уровне экспрессии мРНК основных генов плюрипотентности Nanog, Oct4 и Sox2. Следует отметить, что, нокаут uPAR приводит к увеличению химиорезистентности опухолевых клеток по сравнению с клетками дикого типа: добавление цисплатина в среду культивирования клеток, не экспрессирующих урокиназный рецептор, вызывает снижение экспрессии каспазы-3 и ее энзиматической активности, а также снижает содержание низкомолекулярной формы белка PARP-1. Полученные нами данные позволяют предполагать, что мы обнаружили новый механизм функционирования урокиназной системы в нейробластоме, при котором uPAR, являясь «ловушкой» для uPA, связывает ее на мембране и регулирует ее протеазную активность. Экспрессия uPAR обеспечивает поддержание эпителиального фенотипа клеток Neuro2a. Нокаут uPAR хоть и снижает пролиферацию клеток, тем не менее, приводит к транслокации uPA в ядро и активации экспрессии генов ЭМП, увеличению миграторного потенциала Neuro2a клеток. Заключение. Наши данные позволяют предполагать, что uPAR в клетках опухоли является многофункциональной молекулой. Сложность молекулярных каскадов и многогранность перекрестных сигнальных путей, активируемых урокиназной системой, возможно, является причиной отсутствия положительных эффектов от использования блокирующих урокиназную систему агентов в клинических исследованиях в онкологии. Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-75-30007).
Добавил в систему: Семина Екатерина Владимировна

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИСТИНА ЦЭМИ РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИСТИНА ЦЭМИ РАН

Молекулярные механизмы участия урокиназной системы в канцерогенезе, метастазировании и эпителиально-мезенхимальном переходестатья Тезисы

Прикрепленные файлы