Аннотация:Разработка новых быстрых методов скрининга лекарственных средств требует изучения механизма их действия на живые организмы. Биолюминесцентные тест-системы на основе живых клеток для определения чувствительности микроорганизмов к лекарственным средствам приобретают все большую популярность благодаря их высокой чувствительности и быстроте проведения анализа. Тест-система на основе живых рекомбинантных клеток E. сoli, экспрессирующих термостабильную люциферазу светляков Luciola mingrelica, эффективно используется для мониторинга концентрации АТР и активности белка-люциферазы светляков внутри и вне клеток в режиме реального времени. Это позволяет оценить жизнеспособность и метаболическую активность клет-ки, рассчитать численность микроорганизмов, определить степень повреждения клеточной мембраны, изучить влияние антибактериальных агентов на систему синтеза/гидролиза АТР и на дыхательный метаболизм клетки. В данной работе изучено действие высокоэффективных антибиотиков полимиксинового ряда и аминогликозидовна клетки E.coli с помощью данной тест-системы.Мы показали, что поликатионные циклические полипептиды (полимиксины), быстро проникая в периплазматическое пространство через внешнюю мембрану, воздействуют прежде всего на систему синтеза АТР, локализованную на внутренней мембране клетки. Это приводит к быстрому снижению до нулевых значений содержания внутриклеточного АТР (АТРin) при незначительном увеличении внеклеточного АТР (АТРout), т.е. синтез АТРin прекращается, а остаточное содержание АТРin расходуется внутри клетки. Люциферазная активность снижается внутри клетки (Lucin) и растет вне клетки (Lucout), что свидетельствует о необратимых повреждениях внешней и внутренней клеточной мембраны. Данные посевов подтвердили гибель клеток в присутствии антибиотика.Иной механизм действия наблюдался для антибиотиков аминогликозидного ряда (на примере гентамицина), который, как принято считать, проникает через клеточную мембрану бактерий, подавляя бактериальный синтез белка в клетке, необратимо связываясь с аминоацильным участком 30S-субъединицы рибосомы. Мы показали,что на начальных этапах реакции ни при каких концентрациях гентамицина (0.05-1 мг/мл) величины Lucin и ATPin не уменьшаются, и только через сутки уровень ATPin снижался до нулевых значений. Уровни АТРout и Lucout несколько возрастали пропорционально количеству добавленного гентамицина. Результаты посевов показали сильное, но не полное снижение количества живых клеток. Таким образом, при воздействии данного антибиотика сохранялся высокий уровень ATPin и Lucin, клетки оставались жизнеспособными, хотя и утратили способность к делению, переходя в состояние живых, но некультивируемых микроорганизмов. Кроме того, было показано, что чувствительность клеток к гентамицину зависит от содержания кислорода в системе: при сниженном содержании кислорода гентамицин был неэффективен; его влияние проявлялось только при сильной аэрации суспензии клеток.Работа выполнена в рамках госрегистрационной темы МГУ имени М.В. Ломоносова Номер ЦИТИС: 121041500039-8.
