ИСТИНА

Отчет объемом 152 страниц, 50 рисунков, 12 таблиц, 29 источников, 3 приложения. Ключевые слова: каталитические антитела, ингибиторы, фосфорорганические соединения, ферментативные субстраты. Объектом исследования являются рекомбинантные иммуноглобулины, проявляющие амидазную и эстеразную гидролитическую активность. Целью работы является структурно-функциональное исследование иммуноглобулинов человека, обладающих эстеразной, амидазной, и протеолитической типами активности; разработка программы внедрения в образовательный процесс нового раздела лекций в рамках курса «Физико-химические методы исследования белков и нуклеиновых кислот», базирующихся на результатах, полученных на данном этапе для студентов и аспирантов высших научно-образовательных учреждений, соответствующих современным мировым стандартам; а также подготовка и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов. На отчетном этапе изучены физико-химических свойства полученных новых иммуноглобулинов-биокатализаторов методами рентгено-структурного анализа, поверхностного плазмонного резонанса и микрокалориметрии. Исследование физико-химических свойств новых биокатализаторов методами рентгено-структурного анализа, позволили определить главные структурные особенности антиген-связывающего центра антитела А.17, среди них нетипичный для каталитических антител глубокий активный центр (15 Å), карман антиген-связывающего центра пространственно разделен на две камеры, на дне нижней из которых расположен реакционный аминокислотный остаток Tyr-L37. Его повышенная нуклеофильность согласуется с изолированным от растворителя положением, петля CDR3 тяжелой цепи, образующая стенку антиген-связывающего кармана, представляет собой разупорядоченную, подвижную структуру, положение которой фиксируется после фосфорилирования, архитектура активного центра обеспечивает стереоспецифичность Fab A.17 по отношению Р(R) энантиомеру фосфоната Х, ковалентная модификация фосфонатом Х сопровождается значительными структурными перестановками. Согласно данным микрокалориметрии реакция модификации антитела А.17 фосфонатом Х является термодинамически выгодной. Полученные значения термодинамических параметров сопоставимы с соответствующими значениями, полученными методом ITC для связывания других антител с гаптенами. Кроме того, порядок величин совпадает с кинетически рассчитанными значениями. Снижение температуры измерения от 37 до 10оС приводит к уменьшению величины DH реакции модификации А.17 фосфонатом Х в три раза. По изменению теплоемкости удалось рассчитать изменение площади белковой поверхности, полученное значение находиться в пределах (175 ̶ 260) Å2 и совпадает с величиной, рассчитанной по кристаллической структуре (240 Å2). В отличие от абзима дикого типа, изменение энтальпии при взаимодействии полностью неактивного мутанта А.17Y-L37F с фосфонатом Х не зависит от температуры. Близкое к нулю значение ∆Cp для реакции модификации мутантного абзима свидетельствует о несущественных изменениях площади поверхности антитела, доступной растворителю, что полностью согласуется с данными об отсутствии ковалентного взаимодействия А.17Y-L37F с фосфонатом Х. Анализ результатов компьютерной симуляции показал, что замена остатка Ser35 в легкой цепи антитела HabA17 на положительно заряженную аминокислоту (Lys или Arg) может привести к лучшей стабилизации переходного комплекса. Полученное мутантное антитело HabA17 S35R показало существенно более высокое значение эффективности при взаимодействии с параоксоном, что свидетельствует о том, что продемонстрированный подход может быть использован для определения субстратной специфичности антител-антидотов, а также дает возможность рационального дизайна с целью улучшения нейтрализующих свойств антител-антидотов. Анализ предстационарной кинетики взаимодействия А.17 с фосфонатом Х наряду с данными структурного анализа и изучением термодинамики процесса указывает на реализацию антителом механизма индуцированного соответствия. Тем не менее, полученные результаты не исключают возможности осуществления модификации абзима по альтернативному пути взаимодействия. Пример каталитического антитела А.17 раскрывает альтернативный способ решения проблемы реорганизации белковой структуры для выполнения каталитической функции. Уникальные свойства примитивного активного центра антитела А.17, способного к катализу, являются моделью сочетания белковой динамики и реактивности. Сама по себе иммуноглобулиновая структура абзима накладывает строгие границы подвижности его структуры. Однако принцип получения искусственного фермента может быть приложен сходным образом к любой другой белковой матрице. Хотя, проведение прямых экспериментов на животных in vivo с данным абзимом в условиях острого отравления нецелесообразно, положительные данные по доклиническим испытаниям и литературные данные по фармакодинамике предполагают использование препарата для терапии хронических отравлений ФОТ. Базируясь на результатах, полученных на данном этапе, разработана программа внедрения в образовательный процесс нового раздела лекций в рамках курса «Физико-химические методы исследования белков и нуклеиновых кислот». Полученные данные, а именно принципы получения искусственного фермента на базе иммуноглобулиновой матрицы, могут быть использованы в университетах, институтах, исследовательских центрах и других научно-исследовательских организациях химико-биологического профиля, занимающихся проблемами получения новых биокатализаторов; а также в биотехнологических подразделениях фармацевтических компаний и фирмах-производителях наукоемкой продукции, основным направлением исследований которых является создание, наработка и внедрение препаратов иммуноглобулинов. Разработанные научно-методические пособия могут быть использованы в высших учебных заведениях РФ при чтении курсов лекций для студентов и аспирантов по направлениям: «биоорганическая химия», «биотехнология», «молекулярная биология», «медицинская химия», «химия природных соединений», «биохимия», «иммунология».