ИСТИНА

Проект посвящен изучению фотофизических свойств фотоактивных белков. В качестве модельного объекта выбран оранжевый-каротиноидный белок (Orange Carotenoid Protein, OCP), являющийся сенсором, регулятором и эффектором нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом цианобактерий. Нативная структура ОСР, гомологичная многим белкам-сенсорам из группы Light-Oxygen-Voltage-sensing (LOV), содержит каротиноид 3-гидроксиэхиненон, способный изменять конформацию пигмент-белкового комплекса и его функциональное состояние при поглощении квантов света в диапазоне 450-530 нм. На данный момент последовательность конформационных превращений, происходящих после поглощения кванта света хромофором, изучена не достаточно подробно. Интерес к данному фотоактивному белку вызван не только возможностью использовать его как молекулярный оптический переключатель, но также его частичной гомологичностью фактору ядерного транспорта 2 (nuclear transport factor 2), а также способностью эффективно тушить активные формы кислорода. В рамках проекта, с помощью современных спектральных методов будет выполнено исследование динамики фотоиндуцированных изменений спектрально-временных характеристик хромофора и белковой матрицы ОСР и других фотоактивных белков. Исследование позволит не только изучить механизмы регуляции нефотохимического тушения флуоресценции у цианобактерий, но также получить информацию о динамике конформационных изменений в фотоактивных белках. Результаты исследования могут быть использованы для разработки новых белковых сенсорных систем (триггеров) для современных методов исследований биологических систем (в том числе оптогенетики).

Нами было впервые показано, что в качестве индикатора структурных изменений OCP можно использовать его собственную (триптофановую) флуоресценцию, чувствительную к изменениям, связанным с фотоактивацией. Аналогичный подход применялся ранее для исследования изменения конформации другого фотосенсорного белка – PYP (photoactive yellow protein), для которого был показан перенос энергии с триптофанового остатка на хромофор, а также показана “неупорядоченность” структуры сигнального состояния. В наших экспериментах было показано, что интенсивность собственной флуоресценции OCP растет при его фотоактивации, а характерное время снижения интенсивности свечения после выключения синего света близко ко времени перехода ОСР из активной красной формы в оранжевую, определенному по изменению спектральных характеристик (спектра поглощения) хромофора. Таким образом, установлено, что динамика структурных и спектральных изменений OCP при его фотоактивации совпадает, что подтверждает определяющую роль белковой матрицы в формировании красной формы хромофора. Также нами впервые было установлено, что ОСР способен образовывать комплексы с гидрофобными красителями и, на примере Нильского Красного показано, что переход из оранжевой формы в красную сопровождается увеличением доступности для растворителя центральной впадины между N и С-доменами ОСР, что говорит о значительных изменениях третичной структуры белка. С помощью комбинации рамановской спектроскопии и методов молекулярного моделирования мы установили, что одним из первых конформационных изменений хромофора ОСР может являться поворот кольцевой группы в С-домене, сопровождающийся разрывом водородных связей. Вышеперечисленные результаты легли в основу статьи, опубликованой в 2015 году в престижном журнале Biophysical Journal (Maksimov, E. G., et al. (2015). "The Signaling State of Orange Carotenoid Protein." Biophys J 109(3): 595-607). Разработана методика изучения процессов преобразования энергии в нативных и гибридных структурах. Изучены процессы переноса энергии в фикобилисомах Acaryochloris marina, а также возможность создания гибридных структур типа квантовая точка – фикобилипротеин. Создана установка для регистрации температурных зависимостей спектрально-временных характеристик пигмент-белковых комплексов. Показана возможность экспрессии инфракрасных флуоресцентных белков (IRFP) из фитохромов RpBphP2 Rhodopseudomonas palustris и реконструкция с биливердином в E. coli для спектральных исследований. Вышеперечисленные методики были использованы для создания нашими немецкими коллегами штамма – продуцента ОСР. Данная система позволила нам перейти от выделения белка из цианобактерий к выделению ОСР из E.coli, что значительно расширило наши экспериментальные возможности, как в плане количества и качества препарата, так и в плане возможных модификаций белка. Это стимулировало наши исследования ОСР и в 2016 нами было подготовлено 5 статей по данной теме (2 опубликованы в ВВА и Photosynthesis Research, еще 3 находятся на рассмотрении в журналах Biophysical Journal и Photosynthesis Research), создания конструкций на основе ОСР и изучения их фотоактивности. Нами был впервые получен и охарактеризован мутант ОСР с заменой триптофана-288 на аланин. Данный мутант обладает интенсивной пурпурной окраской (Maksimov, E. G., et al. (2016). "A comparative study of three signaling forms of the orange carotenoid protein." Photosynthesis Research 130(1-3): 389-401), по величине гидродинамического радиуса и функциональной активности соответствует красной активной форме ОСР (Sluchanko, N. N., et al. (2016). "The purple Trp288Ala mutant of Synechocystis OCP persistently quenches phycobilisome fluorescence and tightly interacts with FRP." Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics 1858(1): 1-11). Таким образом, мутант W288A является удобным и перспективным модельным объектом для изучения активной формы ОСР, поскольку этот препарат является достаточно термостабильным и не требует предварительной активации. Данный препарат будет изучен с помощью методов ЯМР спектроскопии и SAXS. Для проверки гипотезы о перемещении каротиноида между доменами ОСР нами был проведен эксперимент, в котором мы провели селективное мечение цистеинов флуоресцентным красителем тетраметилродамином. В результате был получен комплекс, флуоресценция которого обратимо изменяется в ответ на фотоконверсию ОСР. Исследование спектрально-временных характеристик данного комплекса позволило нам, используя теорию Ферстера, оценить изменение расстояния между флуоресцентным красителем и хромофором ОСР при переходе из оранжевой формы в красную. Наши результаты подтверждают гипотезу о том, что каротиноид покидает С-домен (статья проходит рецензию в Biophysical Journal). Также данная конструкция позволяет изучать взаимодействие и образование комплексов с ядрами фикобилисом или FRP с помощью ряда удобных и доступных методов флуоресцентной спектроскопии. Нами было показано, что скорость конверсии комплекса ОСР-TMR зависит от температуры и вязкости среды, что позволяет рассматривать данную систему как сенсор этих важных экспериментальных параметров. В 2016 нами была подана совместная заявка на проведение эксперимента SEC-SAXS в EMBL на синхротроне DESY (Гамбург, Германия). Заявка была поддержана и в результате эксперимента, проведенного Н.Н.Случанко в лаборатории EMBL (в группе под рук. Д.И.Свергуна) , нами были получены предварительные данные о структуре OCP, мутанта ОСР-W288A, представляющего активную красную форму, FRP и комплекса FRP/ОСР-W288A. В результате поставленных крайне информативных экспериментов определен курс дальнейших исследований и установлены необходимые контакты в EMBL для проведения совместных работ по структуре комплексов ОСР/FRP методом SAXS.