ИСТИНА

Одним из важнейших направлений современной фармакологии является поиск фундаментальных принципов для получения соединений, на основе которых могут быть созданы новые лекарственные препараты, что, в свою очередь, представляет собой ключевое звено в системе обеспечения национальной безопасности, поэтому выпуск отечественных лекарственных средств с целью импортозамещения принадлежит к числу первостепенных задач инновационного развития РФ. По данным Всемирной организации здравоохранения, заболевания, связанные с нарушением функций ЦНС, по росту смертности стоят на третьем месте после онкологических и сердечно-сосудистых патологий. В связи с этим актуальной проблемой современной фармакологии является разработка новых фундаментальных подходов, концепций и методологий, позволяющих осуществлять направленный поиск соединений, обладающих ЦНС-корректирующим действием. Научная новизна предлагаемого проекта заключается в разработке новых классов структур, эффективно воздействующих на функции ЦНС, на основе комплексного применения фундаментальных подходов к конструированию лекарственных веществ: (1) методы компьютерного молекулярного моделирования для поиска связи биологической активности мишень-ориентированных соединений с локальными характеристиками молекул, (2) оптимизация требуемых характеристик молекул – геометрии, расположения специфических функциональных групп, липофильности, полярности и др., (3) разработка и оптимизация синтетических схем с целью удешевления конечного продукта и масштабирование синтеза для полупромышленного производства, (4) комплексные биологические исследования, выявление связи структура-активность и оптимизация молекул-лидеров. Стратегия выполнения научного исследования с использованием данного подхода существенным образом отличается от применяемых ранее методов тотального скрининга низкомолекулярных органических соединений, выделения и изучения свойств природных соединений и синтеза аналогов известных лекарственных препаратов. В результате поэтапного выполнения исследований, предлагаемых в проекте, будут получены прорывные научные результаты как фундаментального характера (создание эффективных методов для получения новых серий физиологически активных соединений, выявление принципиальных закономерностей взаимосвязи «структура-активность»), так и создана база для дальнейшего проведения расширенных работ с целью перехода к созданию высокоэффективных субстанций лекарственных препаратов нового поколения для терапии нарушений функций ЦНС (создание широкой библиотеки мишень-ориентированных структур, удовлетворяющих требованиям конструирования активных веществ, разработка лабораторных и опытно-промышленных регламентов получения экспериментальных образцов и их наработка, представление обширных баз данных по биологическому скринингу).

One of the most important areas of modern pharmacology is the search for the fundamental principles to design the compounds that can serve as a basis for the development of novel drugs. This, in turn, is a key element of the national security system. Thus, the introduction of domestic drugs for the purposes of import replacement can be regarded as one of the primary tasks of the innovative development of Russian Federation. According to the World Health Organization, the diseases involving the disruption of CNS functions are ranked as the third in mortality growth after oncological and cardiovascular pathologies. Taking this into account, one of the urgent problems of modern pharmacology is the development of novel approaches, concepts and methodologies supporting the directed search for chemical compounds that possess a CNS corrector activity. The scientific novelty of the proposed project lies in the development of the new classes of structures efficiently modulating the CNS function, based on the integrated application of the fundamental drug design approaches: (1) the methods of computer-aided molecular modeling for the elucidation of relationships between the bioactivity of target-oriented compounds and their local molecular properties, (2) the optimization of the required properties of the molecules, such as geometry, positions of specific functional groups, lipophilicity, polarity, etc., (3) the development and optimization of synthetic schemes to reduce the final product prices and the scale-up of the synthesis for pilot industrial production, (4) the integrated biological studies, elucidation of the structure-activity relationships and optimization of lead compounds. The strategy of a scientific research based on this approach differs significantly from the previously employed methods involving total screening of small-molecule organic compounds, isolation and study of natural compounds, or synthesis of analogs of known drugs. As a result of a staged implementation of the proposed research, both the breakthrough fundamental scientific results will be obtained (development of efficient methods for the production of novel series of physiologically active compounds, elucidation of significant structure-activity relationships) and the basis for subsequent extended research aimed at the translation to the development of a new generation of highly efficient pharmaceutical substances for the treatment of the CNS function disruption will be created (formation of a broad library of target-oriented structures satisfying the requirements of active substance design, development of the laboratory and pilot industrial protocols and the production of experimental samples, preparation of comprehensive biological screening databases).

В ходе выполнения проекта будут получены следующие результаты: – разработан метод дизайна молекулярных структур на основе сочетания дополняющих друг друга методов молекулярного моделирования, анализа связи структура-активность и виртуального скрининга с целью создания оригинальных структурных классов лигандов глутаматных рецепторов; – синтезированы серии новых соединений – положительных аллостерических модуляторов глутаматных AMPA-рецепторов, полученных на основе новых скаффолдов; – проведены комплексные биологические испытания серий новых синтезированных соединений, потенциально обладающих искомой активностью; – осуществлена оптимизация структур соединений-лидеров с целью достижения оптимальной эффективности, необходимых фармакокинетических и фармакодинамических параметров, а также проведен комплекс исследований для наиболее перспективных веществ с целью отбора кандидатов для ранних доклинических исследований. Научная значимость проекта заключается в разработке фундаментальных подходов к созданию новых веществ, потенциально обладающих необходимыми свойствами для эффективной терапии патологий ЦНС с использованием современной мишень-ориентированной методологии дизайна лекарств (drug design), которая включает такие принципы, как выбор молекулярных биомишеней; дизайн структур с использованием инструментов компьютерного молекулярного моделирования; направленный синтез, наработка экспериментальных образцов; скрининг физиологической активности; изучение зависимости «структура-активность» и оптимизация соединений-лидеров. Таким образом,основным итогом выполнения настоящего проекта станет создание нового поколения физиологически активных веществ, обладающих широким спектром действия, направленного на коррекцию функций центральной нервной системы и являющихся основой для последующей разработки оригинальных отечественных лекарственных препаратов. С учетом оригинальности структур предлагаемых веществ, соединения-лидеры будут предметом патентования, а также предложены для доклинических испытаний.

У исследовательского коллектива имеется значительный опыт в области направленного многостадийного синтеза физиологически активных соединений, разработки методов анализа связи «структура-активность», молекулярного моделирования структуры биологических мишеней и их взаимодействия с лигандами, построения фармакофорных моделей и моделей QSAR, компьютерного молекулярного дизайна и виртуального скрининга потенциально активных соединений, а также в области широкого спектра исследований биологической активности. У научного коллектива имеются собственные разработки в области методов моделирования соотношений структура-активность. Нами разработан метод анализа топологии молекулярного поля (Molecular Field Topology Analysis, MFTA), использующий важнейшие локальные характеристики молекул физиологически активных веществ, которые рассматриваются в единой системе координат. Кроме того, был существенно расширен подход к построению моделей связи «структура-активность» и «структура-свойство» с применением искусственных нейронных сетей, что позволило разработать методы прогнозирования многих важных фармакокинетических параметров лекарственных веществ. Нами впервые построены молекулярные модели и сконструированы новые высокоактивные лиганды для целого ряда важнейших рецепторов ЦНС (в частности, ионотропных рецепторов NMDA, АМРА, ГАМКА и многих других). Детально проанализирован сайт связывания положительных аллостерических модуляторов AMPA-рецепторов, построены компьютерные модели связи структура-активность для этого сайта, позволяющие прогнозировать энергию связывания и активность новых лигандов определенных классов. Это позволяет успешно осуществлять мишень-ориентированный дизайн новых положительных аллостерических модуляторов. Коллектив обладает значительным опытом в разработке и оптимизации многостадийных синтетических схем, создании фокусированных библиотек на основе различных скаффолдов, а также имеется серьезный задел в области масштабирования синтеза (от 50 мг до 1кг).

В ходе работы по проекту в 2020-2021 году выполнено моделирование молекулярной динамики комплексов димерного лиганд-связывающего домена AMPA-рецептора с целым рядом лигандов, проявляющих разные типы активности (неактивные лиганды, положительные модуляторы и отрицательные модуляторы) и принадлежащих к различным химическим классам (как описанных в литературе, так и впервые полученных в ходе выполнения проекта), с целью анализа возможных молекулярных механизмов функционирования рецептора. Полученные результаты показывают, что для подавляющего большинства лигандов (независимо от типа активности) связывание в сайте связывания положительных аллостерических модуляторов на интерфейсе между субъединицами в димерном лиганд-связывающем домене остается стабильным в ходе молекулярно-динамического моделирования, хотя способ связывания может несколько меняться по сравнению с начальной структурой, полученной методом молекулярного докинга. Детальный анализ поведения ключевых параметров геометрии димерного лиганд-связывающего домена в ходе моделирования молекулярной динамики его комплексов с лигандами также не выявил значимых различий, которые могли бы объяснить различный тип активности лигандов, в том числе для родственных соединений. В то же время анализ возможной роли других сайтов связывания AMPA-рецептора, проведенный на примере структурно очень близких трициклических производных биспидина, указывает, что высокая положительная модуляторная активность одного из них, скорее всего, определяется взаимодействием с валидированным сайтом связывания положительных модуляторов димерного лиганд-связывающего домена, тогда как отрицательная модуляторная активность второго соединения может опосредоваться его взаимодействием с сайтом связывания отрицательных аллостерических модуляторов на интерфейсе между лиганд-связывающим и трансмембранным доменами. В целом полученные в ходе выполнения проекта результаты дают возможность предположить, что различные исследованные модуляторы потенциально способны взаимодействовать как с сайтом связывания положительных аллостерических модуляторов в AMPA-рецепторе, так и с другими сайтами связывания в глутаматных рецепторах (AMPA и каинатном), в частности, с сайтами связывания отрицательных модуляторов между лиганд-связывающим и трансмембранным доменом в AMPA-рецепторе, в сайте связывания TARP-зависимых модуляторов AMPA-рецептора, в аминоконцевом домене AMPA-рецептора, а также в сайте связывания димерного лиганд-связывающего домена в каинатном рецепторе. При этом наблюдаемый фармакологический профиль соединения будет определяться балансом взаимодействий с различными сайтами, что может объяснять сложный характер его зависимости от структуры. С использованием уточненных моделей структуры AMPA-рецептора и сайта связывания его аллостерических модуляторов выполнен молекулярный дизайн новых модуляторов, обладающих оптимальным связыванием с рецептором и набором прогнозируемых фармакокинетических параметров и физико-химических свойств. При этом рассматривали скаффолды и хемотипы соединений, перспективность которых была подтверждена предшествующими исследованиями, а также их модифицированные аналоги. Отобрано 30 соединений, для которых по результатам молекулярного докинга возможно связывание с AMPA-рецептором в сайте связывания, характерном для его аллостерических модуляторов. Прогноз ключевых фармакокинетических параметров и физико-химических свойств показывает, что для большинства соединений набор этих параметров близок к оптимальному или, по крайней мере, является приемлемым для соединений-лидеров на ранних этапах разработки лекарств для коррекции нарушений функций центральной нервной системы, хотя в ряде случаев может потребоваться дополнительная оптимизация некоторых параметров. Разработаны и оптимизированы синтетические подходы и осуществлен многостадийный синтез 19 новых соединений-кандидатов, отобранных на основе молекулярного моделирования для первичных или расширенных биологических исследований в качестве потенциальных модуляторов AMPA-рецептора, включая серии бис(пиримидинов) и пиримидин-изоксазолов с гидрохиноновым линкером и бис(изоксазолов) с фенилен(дигидроксиметановыми), фенилен(диаминометановыми), дитиольными и диаминовыми линкерами, бис(амидов) с фениленовым линкером и производных 3,6,9-триазатрицикло[7.3.1.1] тетрадекан-4,8,12-триона, осуществлена оптимизация синтеза и наработка ряда полученных ранее соединений для проведения расширенных биологических исследований in vitro и in vivo, а также изучены подходы к ряду других соединений, представляющих интерес как потенциальные модуляторы AMPA-рецептора. Для 15 синтезированных соединений выполнены биологические исследования in vitro электрофизиологическим методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp) по их влиянию на входящие трансмембранные токи нейронов Пуркинье, вызванные активацией расположенных на этих клетках AMPA-рецепторов при аппликации каиновой кислоты. Показано, что 10 соединений вызывают концентрационно-зависимую потенциацию токов АМРА-рецепторов, т.е. являются их положительными модуляторами. Четыре из них начинают действовать в чрезвычайно низкой концентрации (10–12 М), наибольшая потенциация токов (более чем на 60-75%) достигается в очень низкой концентрации (10–9 и даже 10–11 М), а при дальнейшем увеличении концентрации до 10–6 М происходит уменьшение, но не устранение или инверсия потенцирующего влияния на АМРА-токи нейронов Пуркинье. Пять соединений оказывают блокирующее действие на токи АМРА-рецепторов, т.е. являются отрицательными аллостерическими модуляторами АМРА-рецепторов. Одно из них, по-видимому, является наиболее активным из известных на настоящий момент в мире: его действие начинается при концентрации 10–12 М и сохраняется в диапазоне 7 порядков, вплоть до концентрации 10–6 М, а наибольший блокирующий эффект наблюдается при концентрациях 10–10 – 10–6 М, когда оно вызывает блокаду токов АМРА-рецепторов примерно на 50%. Действие еще двух наиболее активных соединений начинается при концентрации 10–12 М и продолжается в диапазоне 7 порядков, нарастая с увеличением концентрации вплоть до концентраций 10–7 – 10–6 М, при которых блокада токов АМРА-рецепторов достигает 50%. Следует подчеркнуть, что такой результат – 15 активных веществ из 15 исследованных – вряд ли мог быть достигнут без целенаправленного синтеза структур, отобранных по результатам молекулярного моделирования. Для одного соединения исследование ноотропной активности in vivo в тесте Морриса достоверно показало его положительное влияние на формирование памяти у крыс в дозе 1 мг/кг. Для одного соединения выполнено исследование нейропротекторного действия in vitro в модели оксидативного стресса на культуре нейрональных клеток гиппокампа мыши линии НТ-22. Показано, что при внесении соединения сразу после повреждения клеток действием пероксида водорода значимый защитный эффект наблюдается в конечной концентрации до 10–6 М, а при внесении за 24 ч до Н2О2 – до 10–10 М. Исследование in vivo противоэпилептической активности на мышах в модели индукции эпилепсии пентилентетразолом позволило найти новое соединение (отрицательный модулятор AMPA-рецепторов), которое в дозе 0.01 мг/кг показывает выраженную противоэпилептическую активность наравне с препаратом сравнения – вальпроевой кислотой. На основе результатов проведенных исследований два соединения, учитывая наличие у одного из них противоэпилептической, а у другого – ноотропной активности, а также отсутствие острой токсичности, выбраны для проведения в дальнейшем расширенных биологических и ранних доклинических исследований.