ИСТИНА

Аминокислоты являются строительными блоками белков, они определяют их структуру и функцию за счет межмолекулярных взаимодействий. Однако набор природных аминокислот ограничен всего 20 типами, что очевидно является недостаточным даже для осуществления всего многообразия природных функций белков, и именно поэтому для функционирования многих белков и ферментов необходимы дополнительные кофакторы. В связи с этим дизайн белков de novo с заданными функциями на основе ограниченного набора элементов остается сложной задачей и часто сводится к копированию комбинаций природных белковых последовательностей. Однако расширение генетического кода и репертуара используемых аминокислот за счет включения их синтетических аналогов способны решить эту проблему. Рациональный дизайн белков с неканоническими аминокислотами, основанный на квантово-химических расчетах, молекулярной динамике и расчете сетей молекулярных взаимодействий позволяет перейти от стадии проб и ошибок стандартного рекомбинантного мутагенеза к управляемой гипотезами белковой инженерии. Это открывает новые возможности биотехнологического получения белков с принципиально новой функциональной активностью, в том числе для методов диагностики и терапии социально значимых заболеваний. Целью исследовательского проекта является создание на базе биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова научного консорциума в области синтетической биологии для разработки технологий белковой инженерии и получения опыта создания уникальных белковых препаратов с неканоническими аминокислотами для решения актуальных научных задач биологии. В то время как такие лаборатории существуют в США, западной Европе и активно развиваются в Китае, в Российской Федерации до сих пор нет таких центров. Для отработки технологии трансляционного введения неканонических аминокислот в рамках данного проекта нами выбраны флуоресцентные белки, как наиболее перспективный класс генетически кодируемых молекулярных инструментов. Исследовательские задачи предлагаемого проекта включают широкий круг вопросов связанных с направленной модификации белковых комплексов для улучшения их спектральных характеристик и функциональных свойств и последующего применения в биотехнологических, аналитических и терапевтических приложениях.

Amino acids are the building blocks of proteins; they determine their structure and function through intermolecular interactions. However, the set of natural amino acids is limited to only 20 types, which is obviously insufficient even to perform the entire variety of natural protein functions, which is why many proteins and enzymes require additional cofactors for their function. Therefore, the design of de novo proteins with defined functions based on a limited set of elements remains a challenge, and is often reduced to copying natural protein sequences. However, expanding the genetic code and the repertoire of amino acids used to include their synthetic counterparts can solve this problem. Rational design of proteins with noncanonical amino acids based on quantum-chemical calculations, molecular dynamics, and calculation of interaction networks allows one to move from the trial-and-error stage of standard recombinant mutagenesis to a hypothesis-driven level of protein engineering. This opens up new opportunities for biotechnological production of proteins with fundamentally new functional activities, including methods of diagnosis and therapy of socially significant diseases. The research tasks of this project include a wide range of questions related to the study of the principal possibilities of directed modification of proteins and pigment-protein complexes for their subsequent application in biotechnological, analytical and therapeutic applications. To work out the technology of translational introduction of noncanonical amino acids, we chose fluorescent proteins as the most promising class of genetically encoded molecular tools within this project. The research tasks of the proposed project include a wide range of issues related to directed modification of protein complexes to improve their spectral characteristics and functional properties and their subsequent application in biotechnological, analytical, and therapeutic applications.

Выбор флуоресцентных белков в качестве основного объекта исследования на начальных этапах проекта обусловлен значительным опытом работы участников проекта с данным классом объектов. В результате выполнения проекта, на основе множества доступных нам вариантов флуоресцентных белков, будут разработаны новые генетически кодируемые пигмент-белковые комплексы, несущие неканонические аминокислоты в своей структуре, обеспечивающие тонкую настройку спектральных и фотофизических/фотохимических свойств. Такие белки будут характеризоваться сдвигом спектра возбуждения и испускания флуоресценции, повышенной яркостью, большей фотостабильностью или более мощным действием в качестве фотосенсибилизаторов для локального производства активных форм кислорода в клетках. Фотосенсибилизаторы на основе белков могут быть оптимизированы для повышения квантового выхода активных форм кислорода, что позволит снизить интенсивность облучения для достижения желаемого эффекта. Новые красные фотопереключаемые флуоресцентные белки будут востребованы для микроскопии сверхвысокого временного и пространственного разрешения (SMLM, STED, FLIM) для визуализации клеток. Также в рамках проекта будут отработаны методы введения аминокислот, подходящих для селективного мечения белков с помощью подходов т.н. клик-химии (click-chemistry, прим. Нобелевская премия по химии 2022). Будут отработаны новые методы сайт-специфического мечения и визуализации белков в живых клетках за счет “клик”-химии и микроскопии комбинационного рассеяния. Эти направления актуальны не только с точки зрения диагностики, но и для разработки белок-опосредованной доставки специфических молекул для фотодинамической и химиотерапии

В предварительных экспериментах показана возможность включения различных неканонических аминокислот в 201 и 288 положении оранжевого каротиноидного белка.