ИСТИНА

Работа направлена на создание новых технологий с использованием ферментов и ферментных систем для целей промышленности и сельского хозяйства, разработку экспрессных аналитических систем для мониторинга окружающей среды, контроля качества воды, продуктов питания, технологического оборудования, медицинской диагностики. Большое внимание уделяется созданию лекарственных средств нового поколения пролонгированного и нацеленного действия на основе ферментов и их регуляторов для терапии онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и лечения ран.

Будут получены новые данные и разработаны подходы для создания биокаталитических технологий с использованием белков, ферментов и регуляторов их активности для целей промышленности, сельского хозяйства и медицины.

Разработан и изготовлен проточный лабораторный биореактор (типа газ-лифт) для окисления сульфида в элементарную серу, включающего автоматический контроль pH и концентрации растворенного кислорода и сульфида, позволяющий получить степени окисления сульфида (94-98%) при нагрузках 0,2-0,6 кг S/м3 реактора/ч. и 95% конверсию сульфида в элементарную серу. Достигнутые показатели открывают хорошие перспективы для пилотных испытаний разработанного процесса и его внедрения в практику. Получены высокоактивные биокатализаторы с фосфотриэстеразной активностью на основе высокоочищенного фермента и клеточного экстракта, иммобилизованные на хлопчатобумажной ткани, исследованы их кинетические характеристики. Изучены возможности ферментативного синтеза ампициллина в гомогенной водной среде и в промышленно важных условиях гетерогенной системы «водный раствор-осадок». Показано, что стабильность двух потенциальных катализаторов такого процесса – пенициллинацилаз из E.coli и из A.faecalis как в водных растворах, так и гетерогенных системах «водный раствор-осадок» достаточно высока для создания эффективного биокаталитического процесса. Впервые в России разработан биотехнологический способ получения высокоактивных препаратов ферментов карбогидраз с помощью штамма Pennicilium funiculosum, изучены их основные свойства и показана перспективность их использования в качестве кормовых добавок. По своему составу и активности отдельных компонентов карбогидразный комплекс не уступает лучшим мировым аналогам. Показано, что в состав карбогидраз гриба входят, главным образом, целлюлазы, ксиланазы и манноназы. Наработана опытная партия ферментного препарата для последующих испытаний в условиях производства. Изучено действие сочетания бактериолитических ферментов с некоторыми антисептиками на микрофлору мастита. Получены опытные образцы препарата на основе сочетания бактериолитического ферментного комплекса “Лизоамидаза” с тетраборатом натрия, действующего как на грамположительную микрофлору мастита, так и на некоторые виды грамотрицательных микроорганизмов. Опытные образцы препарата прошли предварительные клинические испытания. С целью создания способов повышения устойчивости высших растений к фитопатогенным формам грибов проведены иcпытания действия препаратов пектиназы, гемицеллюлазы и целлюлазы на иммунологический статус растения на примере экосистемы корень моркови - Scltrotinia libertiana (возбудитель белой гнили). Установлено снижение повреждающего действия инфекции под влиянием ферментных препаратов, понижение проницаемости мембран клеток инфицированной ткани, стимуляция ее защитных реакций, что проявляется в стабильном повышении уровня фенольных веществ, образовании тканевых защитных барьеров. Применение всех перечисленных ферментов оказалось полезным при переработке макулатуры и отбеливании целлюлозы. Разработаны методы выделения, очистки и иммобилизации циклодекстринтрансферазы микроорганизмов. Получены ферментные препараты шт. ИБ 663 B. Sp. с удельной активностью 8,2 х 10-1 ед/мг и степенью очистки 20,5 и шт. ИБ 663 B. Sp. с удельной активностью 8,5 х 10-1 ед/мг и степенью очистки 40,4. Впервые разработаны тест-системы на основе мембранного иммуноанализа с хемилюминесцентной детекцией для определения пестицидов 2,4-Д, атразина, симазина и тербутилазина и антибиотика хлорамфеникола. Для широко используемых пестицидов – 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты (2,4-Д), 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной кислоты (2-М-4-Х), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т), атразина, пропазина, симазина, хлорсульфурона разработаны и апробированы новые экспрессные иммуноаналитические тест-системы для выявления антигенов в пробах воды. Пределы обнаружения пестицидов (2,4-Д, симазин, атразин, тербутилазин) и антибиотика хлорамфеникола методом мембранного иммуноферментного анализа (ИФА) существенно ниже предельно допустимой концентрации для данных пестицидов в питьевой воде. Разработан метод мембранного ИФА с хемилюминесцентной детекцией для определения остаточных количеств хлорамфеникола в молоке с пределом обнаружения 0.03 нг/мл. Разработана конструкция и изготовлен опытный образец иммуносенсорного датчика на основе мембранного микрочипа с иммобилизованным антигеном, который успешно применен для анализа пестицида атразина. Проведена апробация разработанных тест-систем для контроля содержания пестицидов в различных объектах: питьевая вода, молоко, овощи, мясо. Ошибка методов 6-12%, полнота выявления антигенов от 80%, что свидетельствует об их перспективности для широкого применения. Разработан экспрессный лабораторный метод количественного определения ненасыщенных жирных кислот в свободном состоянии и в составе жиров и растительных масел с помощью биферментной системы «липаза/липоксигеназа» в среде обращенных мицелл. Оптимизированы условия и состав реагентов для биолюминесцентного экспресс-анализа общей бактериальной обсемененности (ОБО) сырого молока. Проанализированы образцы стерилизованного молока, искусственно контаминированного клетками кишечной палочки, и образцы сырого молока с ОБО в интервале 104-106 КОЕ/мл. Разработанная методика проходит апробацию в Институте молочной промышленности. Разработан лабораторный макет экспресс-анализатора биологического потребления кислорода для контроля общей загрязненности окружающей среды ксенобиотиками, включая фенольные соединения. Анализатор изготовлен на основе электрода Кларка, микропотенциостата и биологических мембран (с иммобилизованными ферментами тирозиназой и лакказой, а также ила). Пределы чувствительности для различных фенольных соединений варьируются в интервале концентраций 1.5 – 0.5 мкМ. Мембрана позволяет проводить до 50 анализов фенольных соединений без изменения калибровки. Разработан интегральный биодатчик на основ двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре холестерической жидкокристаллической дисперсии и “сшитых” полимерными хелатными мостиками, и показана возможность его использования для определения химических или биологически активных соединений различной природы. Создан лабораторный прототип амперометрического биосенсора на активность нейротоксичной эстеразы (НТЭ). Разработаны методы анализа НТЭ в крови животных и человека с использованием данного биосенсора. Проведено комплексное in vitro исследование основных свойств тромболитических агентов ацилированного по активному центру производного. Показано, что неактивная ацилурокиназа служит депо, которое высвобождает активную урокиназу, в достаточной концентрации для инициирования тромболизиса. Ацильная группа защищает фермент от нейтрализации ингбиторами плазмы и деградации, а такж вызывает существенно меньшие побочные эффекты на плазменные белки. Ацилурокиназа может быть использована для длительной терапии тромбозов глубоких вен, тромбофлебитов, а также для профилактики тромбозов. В острых же случаях с целью элиминирования лаг-периода предложено использовать комбинацию ацилированной урокиназы со свободной урокиназой. Найдена оптимальная комбинация (4:1), которая улучшает тромболитические свойства в острых случаях. Разработан высокочувствительный кинетический микрометод определения концентрации урокиназы, основанный на активации плазминогена. Методами биохимии, инженерной энзимологии и экспериментальной фармакологии показано, что при болюс - инфузия - болюсном или последовательном двойном болюсном введении тромболитической композиции (тканевый активатор плазминогена и конъюгат урокиназы – фибриноген) обнаружена выраженная реканализация тромбированного сосуда и умеренное возмущающее действие на систему фибринолиза у собак с венозным тромбозом. Обнаружен выраженный антитромботический эффект ковалентного конъюгата супероксиддисмутаза - хондроитинсульфат и каталаза – хондроитинсульфат на модели артериального тромбоза у крыс. Продемонстрирована перспективность методов введения тромболитиков и комбинированной антиоксидантной защиты сосудистой стенки против тромботических осложнений. Создана база для разработки новых ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента и применения их в виде новых лекарственных форм для терапии ожогов и ранениях глазного яблока на кроликах. Для этого проведена локализация углевод-связывающего центра на молекуле фермента, выявлена его специфичность и предложена структура перспективных бифункциональных ингибиторов. Впервые предложена структура перспективных бифункциональных ингибиторов фермента. Впервые показано, что применяемый для лечения гипертонии и сосудисто-сердечной недостаточности каптоприл может быть эффективно использован в виде новой лекарственной формы - глазных капель при лечении ожогов глаз. Эффективность каптоприла превосходит эффективность известного препарата «Гордокс», применяемого в клинике для лечения ожогов глаз. Разработаны лабораторные методы хроматографического выделения ингибиторов протеиназ из бобов сои. Показано, что классический ингибитор типа Баумана-Бирк подавляет активность химотрипсиноподобных ферментов и эластазы гранулоцитов человека и обладает антиканцерогенными свойствами. Оптимизированы условия хранения сырья с целью сохранения в нем наибольшей ингибирующей активности. Разработаны методы микрокапсулирования лекарственных белков на примере ингибиторов протеиназ и их ингибиторов для перорального, интраназального и пульмонарного применения. Биодеградируемые микросферы разных размеров могут быть получены из природных (белки, полисахариды, оболочки вирусов и живых клеток) и синтетических (полимолочная кислота, сополимер полилактид-гликолид, поли *-капролактон и др.) материалов. Разработаны способы получения микросфер для регуляции скорости высвобождения лекарственного белка. Исследован механизм, контролирующий активацию пропротеиназ, секретируемых поджелудочной железой. В секреторных гранулах дуоденальной слизистой обнаружена новая протеиназа – дуоденаза, ключевой фермент инициирования каскада реакций протеолитического расщепления. Изучены процессы взаимодействия *1-ингибитора протеаз с дуоденазой с целью установления возможности регуляции протеолиза в норме и при воспалениях кишечника. Разработана методика выделения гликозидов изофлавонов из соевой муки, и условия их гидролиза до агликонов, проведена их идентификация методами спектрофотометрии, флуоресценции и ЯМР-спектроскопии. Показана антимутагенная активность смеси изофлавонов в виде агликонов и гликозидов на штаммах Salmonella TA 98 и TA 100 в присутствии прямых мутагенов. Создана методика получения комплексов ингибиторов типа Баумана-Бирк с различными липидными препаратами, выделенными из соевой муки для усиления их проникающей способности через клеточные мембраны и захвата клетками. Показано, что содержание ингибитора в комплексе увеличивается при увеличении содержания в них отрицательно заряженных компонентов. Разработаны образцы новых лекарственных средств для энзимотерапии и иммунотерапии метионин-зависимых злокачественных новообразований (препарат "Лимфокинин" и препарат на основе полноразмерного фрагмента ДНК – аспарагиназа). Созданы научно-обоснованные схемы коррекции и разработан кинетический метод исследования влияния противоопухолевых веществ на развитие злокачественных патологий. Разработан метод выделения и очистки коллагеназы из гепатопанкреаса камчатского краба с помощью аффинной хроматографии и ультрафильтрации. Проведены успешные испытания по введению очищенной коллагеназы в кровоток животных. Впервые в России на основе коллагеназы создана мазь «Морикрол», обладающая ранозаживляющим действием для лечения ожогов и послеоперационных рубцов. Разработан метод иммобилизации тромбина и высокоаффинного пептида, агониста рецептора тромбина (haTRAP), имитирующего действие тромбина на рецептор, в композитные поливинил-капролактам-кальций-альгинатные гидрогелевые пленки с определенным чередованием слоев хитозана и поли-L-лизина. Установлено, что использование хитозана в наружном слое приводит к удлинению времени освобождения haTRAP из пленок. Выявлено ускорение процесса заживления экспериментальных резаных ран у мышей при аппликации пленок,содержащих haTRAP –хитозан. С помощью световой микроскопии и ауторадиографии образцов грануляционной ткани опытных животных, обнаружено ускорение фаз воспаления и пролиферации клеток. Выделен препарат фермента простагландинсинтазы из органов барана и разработан метод его длительного хранения. Показано, что введение препарата в линейные или ожоговые раны крыс в 2,5 раза сокращает время заживления раны и увеличивает прочность раны в месте заживления. Повторное нанесение фермента оказывает стимулирующее действие на процесс заживления. Предложен метод модификации хитозановых пленок поверхностно-активным веществом, обеспечивающим формирование на пленке слоя, выполняющего роль полупроницаемой мембраны для замедления выделения лекарственного начала во внешнюю среду. Пленка в целом при набухании способна увеличивать объем на 2000-4000%. По способности поглощать и удерживать влагу разработанный материал превосходит все известные перевязочные средства. Показана эффективность использования материала для лечения труднозаживающих ран онкологических больных. Разработана технология получения пероральной лекарственной формы ноотропного пептида с использованием различных полимеров в качестве носителей действующей субстанции. Метод основан на принципе криоструктурирования растворов пектина с ноотропом. Показано, что включение ноотропа в высокоэтерифицированный пектин увеличивает время действия препарата в 3 раза и эффективность лекарства в 4 раза при оральном применении. Разработанный подход пригоден для создания пептидных и белковых оральных форм лекарственных препаратов.