Исследование температурных зависимостей спектрально-временных характеристик фотосинтетических мембран цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и её мутантовНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 февраля 2015 г.-31 декабря 2015 г. Исследование температурных зависимостей спектрально-временных характеристик фотосинтетических мембран цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и её мутантов
Результаты этапа: В результате выполненных работ были получены новые данные о функционировании фотосинтетических мембран цианобактерий. В частности, с помощью спектрофлуориметрии с пикосекундным временным разрешением были изучены кинетики активации нефотохимического тушения и последующего восстановления флуоресценции фикобилисом с различным набором терминальных эмиттеров. Для этих целей были выбраны мутанты Synechocystis из коллекции кафедры генетики Биологического факультета МГУ, а именно мутанты лишенные фотосистем и дополнительно некоторых типов аллофикоцианинов, являющихся терминалььными эмиттерами флуоресценции. Известно, что сайтом взаимодействия фикобилисом и оранжевого каротиноидного белка является именно ядро фикобилисомы, поэтому задачей эксперимента являлось сопоставление кинетических кривых активации нефотохимического тушения и последующего восстановления флуоресценции фикобилисом с различным строением ядра. Выбор именно таких мутантов обусловлен удобством изучения медленных процессов активации нефотохимического тушения и последующего восстановления флуоресценции фикобилисом, поскольку отсутствует характерная для ФС2 индукция флуоресценции. Измерение зависимости интенсивности и времени жизни флуоресценции от времени темновой адаптации проводились для данных объектов впервые. Более детально схема эксперимента будет описана в разделе «Методы и подходы». Результаты экспериментов показали, что энергия активации нефотохимического тушения у дикого типа Synechocystis, мутанта лишенного фотосистем и мутантов по генам apcD и apcF (кодирующим терминальные эмиттеры) практически не отличается, однако, были обнаружены значительные различия в зависимостях скорости восстановления флуоресценции от температуры. Наибольшим активационным барьером обладал дикий тип, значительно меньшим барьером характеризовалось восстановление флуоресценции у мутанта лишенного фотосистем, и самым низким активационным барьером обладали мутанты лишенные фотосистем и терминальных эмиттеров. Поскольку восстановление флуоресценции фикобилисом у цианобактерий катализируется специальным белком (fluorescence recovery protein, FRP) мы предполагаем, что взаимодействие FRP с ОСР в комплексе с ядром фикоблилсомы требует стерической доступности комплекса. Вероятно, связь фикобилисом с фотосистемами (за счет линкерного полипептида Lcm), накладывает некоторые (геометрические) ограничения на взаимодействие водорастворимого FRP с комплексом ОСР-ядро, располагающимся вблизи мембраны. Снижение энергии активации восстановления флуоресценции при замене терминальных эмиттеров на аллофикоцианин у мутантов говорит о снижении прочности комплекса ОСР-ядро, таким образом, ApcD и ApcF играют роль не только переносчиков энергии возбуждения между фикобилисомой и реакционными центрами, но также, вероятно, необходимы для стабилизации комплекса ядра с ОСР при активации нефотохимического тушения флуоресценции. Анализ кинетик затухания флуоресценции фикобилисом в различных состояниях позволил выявить несколько интересных особенностей, например время достижения максимума интенсивности увеличивалось при восстановлении флуоресценции. Моделирование кинетик позволило связать данные изменения с ростом времени жизни, однако это означает что сопоставление так называемых decay associated spectra для фикобилисом и фикобилисом в комплексе с ОСР крайне неинформативно, поскольку вклад компонента с отрицательной амплитудой (характеризующего миграцию энергии от коротковолновых пигментов к длинноволновым) в данном случае будет меняться в зависимости от времени жизни акцептора. Следует отметить что кинетические кривые восстановления флуоресценции фикобилисом обладали s-образной формой характерной для некоторых ферментативных реакций. Кроме того, мы обнаружили, что скорость восстановления флуоресценции уменьшается с увеличением амплитуды нефотохимического тушения флуоресценции, вероятно, из-за истощения субстрата для ферментативной реакции, катализируемой FRP. Результаты моделирования кинетических кривых восстановления флуоресценции фикобилисом и модель взаимодействия FRP и OCP являются основой стати, которая будет опубликована в 2016м году. Опыты, в которых нами производились измерения кинетики затухания флуоресценции фикобилисом в клетках цианобактерий Synechocystis sp. PCC6803, лишенных фотосистем, показали, что эффективность дезактивации возбуждения антенных комплексов молекулой OCP не является фиксированной величиной и плавно зависит от времени облучения системы синим светом (стадия индукции нефотохимического тушения) и времени адаптации образца к темноте (стадия восстановления флуоресценции). Фактически, в кривых затухания флуоресценции фикобилисом при присоединении к ним активированного OCP появляется короткая компонента, скорость которой меняется от (170 пс)-1 при максимальной амплитуде нефотохимического тушения до (900 пс)-1 для адаптированного к темноте образца. Данный факт был интерпретирован нами как проявление межмолекулярного взаимодействия между OCP и сайтом его связывания на фикобилисоме и стимулировал дальнейшее исследование конформационных изменений OCP при его фотоактивации. Для этого были проведены процедуры по выделению и очистке препарата ОСР из клеток цианобактерий для дальнейших экспериментов in vitro. Нами было впервые показано, что в качестве индикатора структурных изменений OCP можно использовать его собственную (триптофановую) флуоресценцию. Аналогичный подход применялся ранее для исследования изменения конформации другого фотосенсорного белка – PYP (photoactive yellow protein), для которого был показан перенос энергии с триптофанового остатка на хромофор, а также показана “неупорядоченность” структуры сигнального состояния. В наших экспериментах было показано, что интенсивность собственной флуоресценции OCP растет при его фотоактивации, а характерное время снижения интенсивности свечения после выключения синего света близко ко времени перехода ОСР из активной красной формы в оранжевую, определенному по изменению спектральных характеристик (спектра поглощения) хромофора. Таким образом, установлено, что динамика структурных и спектральных изменений OCP при его фотоактивации совпадает, что подтверждает определяющую роль белковой матрицы в формировании красной формы хромофора. Также нами впервые было установлено, что ОСР способен образовывать комплексы с гидрофобным красителем - Нильским Красным. Для определения сайта взаимодействия красителя и белка был применен метод молекулярного докинга, установлено, что наиболее вероятным местом встраивания красителя является впадина между доменами белка. Нами было экспериментально показано, что переход из оранжевой формы в красную сопровождается увеличением доступности для растворителя центральной впадины между N и С-доменами ОСР, что говорит о значительных изменениях третичной структуры белка. С помощью комбинации рамановской спектроскопии и методов молекулярного моделирования мы установили, что одним из первых конформационных изменений хромофора ОСР может являться поворот кольцевой группы в С-домене, сопровождающийся разрывом водородных связей. Анализ экспериментальных данных и сопоставление результатов с исследованиями других фотоактивных белков позволил нам выдвинуть гипотезу о том, что красная форма ОСР является расплавленной глобулой. Вышеперечисленные результаты легли в основу статьи, опубликованной в 2015 году в журнале Biophysical Journal (IF = 3.972). Также нами получены данные о температурных зависимостях скоростей восстановления и окисления пула хинонов, а также изменениях структурной организации фотосинтетических мембран цианобактерий. Для этих целей нами были проведены эксперименты по изучению холодового стресса на дикий тип и мутант Synechocystis по десатуразам из коллекции Института физиологии растений РАН. Поскольку активность десатураз приводит к увеличению содержания полиненасыщеных жирных кислот, снижающих вязкость мембран наибольшие различия обнаружены между диким типом выращенным при нормальных и стрессовых условиях. Однако, важным фактором влияющим на скорость диффузии хинонов является не только температура и состав жирных кислот, но также упорядоченность белковых структур. Об этом свидетельствуют результаты полученные с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Сопоставление спектров комбинационного рассеяния дикого типа, выращенного при 33 и 25 °С, позволило выявить характерные различия – изменение соотношения интенсивности полос 1160 и 1526 см-1, а также сдвиг полосы 1526 см-1. Данные различия могут объясняться изменением длинны сопряжения или увеличением упорядоченности структуры каротиноидов при культивации в условиях пониженных температур. Вероятно, в условиях холодового стресса может происходить изменение количества каротиноидов связанных с мембранными белками и находящихся в липидной мембране. В ходе работы мы столкнулись с тем, что известная для водорослей методика оценки степени ненасыщенности по соотношению интенсивности полос 1650/1440 см-1 в КР спектре при использовании 785 нм лазера, не подходит для цианобактерий, поскольку у последних в данных областях значительный вклад вносят фикобилипротеины. Таким образом, отнесение сигналов в спектрах комбинационного рассеяния целых клеток цианобактерий и разработка подхода для оценки степени ненасыщенности является интересной задачей (как самостоятельной, так и для оценки изменений состояния фотосинтетических пигмент-белковых комплексов), которая будет решена нами в ходе дальнейшей работы.
2 1 января 2016 г.-31 января 2016 г. Исследование температурных зависимостей спектрально-временных характеристик фотосинтетических мембран цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и её мутантов
Результаты этапа: В рамках работ второго года были проведены исследования температурных зависимостей ряда процессов, связанных с регуляцией фотосинтетических реакций у цианобактерий. Во-первых, получены оценки скоростей восстановления и окисления пула хинонов в клетках дикого типа Synechocystis и мутанта по десатуразам. Было показано, что данные скорости зависят от температуры, а температурная зависимость скорости окисления пула хинонов характеризуется фазовым переходом при температуре близкой к температуре культивации. Таким образом, показано, что снижение вязкости фотосинтетических мембран, при длительной адаптации к пониженным температурам, вызванное активацией десатрураз, приводит к увеличению скорости окисления пула хинонов. Данный эффект не наблюдается у мутанта по десатуразам. Регуляторные изменения вязкости мембран были также подтверждены в экспериментах in vitro с помощью анизотропии флуоресценции и спектроскопии комбинационного рассеяния и сопоставлены с данными об экспрессии ряда генов. Основные результаты были подготовлены для публикации и представлены в журнал Photosynthesis Research. Во-вторых, нами был получен и охарактеризован новый мутант оранжевого каротиноидного белка (Orange, Carotenoid Protein, ОСР). Замена триптофана-288 на аланин приводит к появлению у данной модификации ОСР ряда признаков характерных для активной красной формы. Более того, данный мутант оказался функционально активным – способным вызывать тушение флуоресценции фикобилисом и взаимодействовать с белком восстановления флуоресценции (Fluorescence Recovery Protein, FRP). Создание этого мутанта позволило решить проблему изучения свойств термодинамически нестабильной красной формы, что позволило получить важную информацию о комплексах ОСР. Основные результаты опубликованы в журнале Photosynthesis Research и BBA: Bioenergetics. В-третьих, изучение температурных зависимостей фотоконверсии ОСР in vitro привело нас к созданию гибридных конструкции на основе этого белка и ряда флуоресцентных красителей. Ковалентное мечение ОСР красителем на основе тетраметилродамина по трем цистеинам позволило нам получить систему, флуоресценция которой чувствительна к фотоиндуцированой изменению конформации ОСР. Анализ данных изменений позволил визуализировать перемещение каротиноида внутри белка и разработать метод для детектирования локальных изменений температуры и вязкости среды. Результаты исследования представлены в журнал Biophysical Journal (на момент подачи отчета статья принята, но doi еще не присвоен).
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование температурных зависимостей спектрально-временных характеристик фотосинтетических мембран цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и её мутантов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".