| 1 |
1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. |
Дизайн среды как средство направленного изменения аналитических характеристик ферментативных методов определения биологически активных субстратов и эффекторов пероксидаз в водно-органических растворах |
| Результаты этапа: В результате выполнения проекта продемонстрировано, что конструирование оптимального надмолекулярного дизайна реакционной среды (выбор оптимальных биокатализаторов и активаторов; варьирование природы, рН и концентрации водных буферных растворов; применение полярных органических растворителей молекулярной и ионной природы (ионных жидкостей, ИЖ); включение ферментов в мицеллы ПАВ) позволяет направленно регулировать субстратную специфичность и каталитическую активность коммерческих растительных пероксидаз: пероксидазы хрена (ПХ) и пероксидазы сои (ПС). Последние обеспечивают высокочувствительное, селективное и экспрессное определение их субстратов: восстановителей (катехоламинов, производных фенола, серосодержащих соединений) и окислителей (органических пероксидов и эндопероксидов), в водных и водно-органических средах, в том числе и с малым содержанием воды. Для экспрессного ферментативного определения катехоламинов (КА) ? медленно окисляемых в водной среде субстратов пероксидаз – а-метилдопы, допамина, адреналина в диапазонах концентраций 10–100, 0,5–100, и 1–200 мкМ соответственно, предложен подход, основанный на стимулирующем действии на скорость их пероксидазного окисления (контролируемую спектрофотометрическим методом) активаторов: 4-аминоантипирина и гормона L-тироксина. Использование ПХ, а не ПС, в качестве катализатора реакций окисления КА пероксидом водорода, а также выбранных активаторов и оптимальных природы, рН и концентрации буферного раствора (0.1 М фосфатной буферной смеси) обеспечивают высокую эффективность ферментативного катализа. Для высокочувствительного (на уровне наномолярных концентраций) и селективного (в присутствии метаболитов) ферментативного определения КА в биологических жидкостях (крови и моче) получены их интенсивно флуоресцирующие производные в результате реакций их дериватизации с мезо-1,2-дифенолэтилендиамином или бензиламином в присутствии ПХ. Введение в реакцию ДМСО, прямых мицелл ПАВ цетилметиламмоний бромида позволило
значительно улучшить метрологические характеристики предложенных ферментативных методик определения КА. Использование вместо ПХ гемоглобина в качестве биокатализатора окисления пероксидом водорода малорастворимых в воде серосодержащих органических субстратов пероксидаз (тиоанизола и дибензотиофена), а также оптимизация условий проведения реакции в среде вода-ацетонитрил позволили достичь высоких степеней биоконверсии указанных соединений. Благодаря замене полярных молекулярных органических растворителей (ДМСО, 1,4-диоксана, ДМФА, ацетонитрила и этанола) на гидрофильные ИЖ - тетрафторбораты 1-бутил-3-метилимидазолия ([BMIm][BF4]) и N-бутил-4-метилпиридиния ([BMPy][BF4]) в реакциях окисления ограниченно растворимых в воде гваякола и о-хлорфенола трет-бутилгидропероксидом пероксидазы сохраняют 20–30% каталитической активности даже при высоких (70–80 об.%) содержаниях ИЖ в системе, при которых катализ в смесях молекулярных растворителей с водой не происходит. С использованием ПХ и ПС разработаны методики определения о-хлорфенола (сН 3–7 мкМ) и гваякола (сн 0,05–0,5 мМ) в средах вода-органический растворитель (20-25% ДМСО или ацетонитрила) и в присутствии 60-80 об.% [BMIm][BF4]. Для ферментативного определения субстратов-окислителей – трет-бутилгидропероксида и 2-бутанонпероксида с смин 0.5 и 1 нМ в нерастворимых в воде объектах (например, оливковых маслах) использован выявленный нами эффект усиления хемилюминесценции флуоресцеина в среде 75 об.% ДМСО при его окислении указанными аналитами в присутствии ПХ. Для определения антималярийных эндопероксидных соединений: природного (артемизинина) и синтетического (1,2,4,5-тетраоксана), стерически затрудненных аналогов H2O2, из изученных 5 ферментативных и 1 неферментативной индикаторных систем выбраны следующие: HCl – Н2О2 – I- и о-дианизидин - ПХ - Н2О2. Разработана методика определения 0.15–1 мМ артемизинина некаталитическим кинетическим методом, и показана возможность ферментативного определения 0.2 – 0.6 мМ
1,2,4,5-тетраоксана.
Все предложенные методики успешно апробированы в анализе фармацевтических препаратов, биологических жидкостей, пищевых продуктов.
|
| 2 |
1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. |
Дизайн среды как средство направленного изменения аналитических характеристик ферментативных методов определения биологически активных субстратов и эффекторов пероксидаз в водно-органических растворах |
| Результаты этапа: В результате выполнения проекта продемонстрировано, что конструирование оптимального надмолекулярного дизайна реакционной среды (выбор оптимальных биокатализаторов и активаторов; варьирование природы, рН и концентрации водных буферных растворов; применение полярных органических растворителей молекулярной и ионной природы (ионных жидкостей, ИЖ); включение ферментов в мицеллы ПАВ) позволяет направленно регулировать субстратную специфичность и каталитическую активность коммерческих растительных пероксидаз: пероксидазы хрена (ПХ) и пероксидазы сои (ПС). Последние обеспечивают высокочувствительное, селективное и экспрессное определение их субстратов: восстановителей (катехоламинов, производных фенола, серосодержащих соединений) и окислителей (органических пероксидов и эндопероксидов), в водных и водно-органических средах, в том числе и с малым содержанием воды. Для экспрессного ферментативного определения катехоламинов (КА) ? медленно окисляемых в водной среде субстратов пероксидаз – а-метилдопы, допамина, адреналина в диапазонах концентраций 10–100, 0,5–100, и 1–200 мкМ соответственно, предложен подход, основанный на стимулирующем действии на скорость их пероксидазного окисления (контролируемую спектрофотометрическим методом) активаторов: 4-аминоантипирина и гормона L-тироксина. Использование ПХ, а не ПС, в качестве катализатора реакций окисления КА пероксидом водорода, а также выбранных активаторов и оптимальных природы, рН и концентрации буферного раствора (0.1 М фосфатной буферной смеси) обеспечивают высокую эффективность ферментативного катализа. Для высокочувствительного (на уровне наномолярных концентраций) и селективного (в присутствии метаболитов) ферментативного определения КА в биологических жидкостях (крови и моче) получены их интенсивно флуоресцирующие производные в результате реакций их дериватизации с мезо-1,2-дифенолэтилендиамином или бензиламином в присутствии ПХ. Введение в реакцию ДМСО, прямых мицелл ПАВ цетилметиламмоний бромида позволило
значительно улучшить метрологические характеристики предложенных ферментативных методик определения КА. Использование вместо ПХ гемоглобина в качестве биокатализатора окисления пероксидом водорода малорастворимых в воде серосодержащих органических субстратов пероксидаз (тиоанизола и дибензотиофена), а также оптимизация условий проведения реакции в среде вода-ацетонитрил позволили достичь высоких степеней биоконверсии указанных соединений. Благодаря замене полярных молекулярных органических растворителей (ДМСО, 1,4-диоксана, ДМФА, ацетонитрила и этанола) на гидрофильные ИЖ - тетрафторбораты 1-бутил-3-метилимидазолия ([BMIm][BF4]) и N-бутил-4-метилпиридиния ([BMPy][BF4]) в реакциях окисления ограниченно растворимых в воде гваякола и о-хлорфенола трет-бутилгидропероксидом пероксидазы сохраняют 20–30% каталитической активности даже при высоких (70–80 об.%) содержаниях ИЖ в системе, при которых катализ в смесях молекулярных растворителей с водой не происходит. С использованием ПХ и ПС разработаны методики определения о-хлорфенола (сН 3–7 мкМ) и гваякола (сн 0,05–0,5 мМ) в средах вода-органический растворитель (20-25% ДМСО или ацетонитрила) и в присутствии 60-80 об.% [BMIm][BF4]. Для ферментативного определения субстратов-окислителей – трет-бутилгидропероксида и 2-бутанонпероксида с смин 0.5 и 1 нМ в нерастворимых в воде объектах (например, оливковых маслах) использован выявленный нами эффект усиления хемилюминесценции флуоресцеина в среде 75 об.% ДМСО при его окислении указанными аналитами в присутствии ПХ. Для определения антималярийных эндопероксидных соединений: природного (артемизинина) и синтетического (1,2,4,5-тетраоксана), стерически затрудненных аналогов H2O2, из изученных 5 ферментативных и 1 неферментативной индикаторных систем выбраны следующие: HCl – Н2О2 – I- и о-дианизидин - ПХ - Н2О2. Разработана методика определения 0.15–1 мМ артемизинина некаталитическим кинетическим методом, и показана возможность ферментативного определения 0.2 – 0.6 мМ 1,2,4,5-тетраоксана.
Все предложенные методики успешно апробированы в анализе фармацевтических препаратов, биологических жидкостей, пищевых продуктов. |
| 3 |
1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. |
Дизайн среды как средство направленного изменения аналитических характеристик ферментативных методов определения биологически активных субстратов и эффекторов пероксидаз в водно-органических растворах |
| Результаты этапа: В результате выполнения проекта продемонстрировано, что конструирование оптимального надмолекулярного дизайна реакционной среды (выбор оптимальных биокатализаторов и активаторов; варьирование природы, рН и концентрации водных буферных растворов; применение полярных органических растворителей молекулярной и ионной природы (ионных жидкостей, ИЖ); включение ферментов в мицеллы ПАВ) позволяет направленно регулировать субстратную специфичность и каталитическую активность коммерческих растительных пероксидаз: пероксидазы хрена (ПХ) и пероксидазы сои (ПС). Последние обеспечивают высокочувствительное, селективное и экспрессное определение их субстратов: восстановителей (катехоламинов, производных фенола, серосодержащих соединений) и окислителей (органических пероксидов и эндопероксидов), в водных и водно-органических средах, в том числе и с малым содержанием воды. Для экспрессного ферментативного определения катехоламинов (КА) ? медленно окисляемых в водной среде субстратов пероксидаз – а-метилдопы, допамина, адреналина в диапазонах концентраций 10–100, 0,5–100, и 1–200 мкМ соответственно, предложен подход, основанный на стимулирующем действии на скорость их пероксидазного окисления (контролируемую спектрофотометрическим методом) активаторов: 4-аминоантипирина и гормона L-тироксина. Использование ПХ, а не ПС, в качестве катализатора реакций окисления КА пероксидом водорода, а также выбранных активаторов и оптимальных природы, рН и концентрации буферного раствора (0.1 М фосфатной буферной смеси) обеспечивают высокую эффективность ферментативного катализа. Для высокочувствительного (на уровне наномолярных концентраций) и селективного (в присутствии метаболитов) ферментативного определения КА в биологических жидкостях (крови и моче) получены их интенсивно флуоресцирующие производные в результате реакций их дериватизации с мезо-1,2-дифенолэтилендиамином или бензиламином в присутствии ПХ. Введение в реакцию ДМСО, прямых мицелл ПАВ цетилметиламмоний бромида позволило
значительно улучшить метрологические характеристики предложенных ферментативных методик определения КА. Использование вместо ПХ гемоглобина в качестве биокатализатора окисления пероксидом водорода малорастворимых в воде серосодержащих органических субстратов пероксидаз (тиоанизола и дибензотиофена), а также оптимизация условий проведения реакции в среде вода-ацетонитрил позволили достичь высоких степеней биоконверсии указанных соединений. Благодаря замене полярных молекулярных органических растворителей (ДМСО, 1,4-диоксана, ДМФА, ацетонитрила и этанола) на гидрофильные ИЖ - тетрафторбораты 1-бутил-3-метилимидазолия ([BMIm][BF4]) и N-бутил-4-метилпиридиния ([BMPy][BF4]) в реакциях окисления ограниченно растворимых в воде гваякола и о-хлорфенола трет-бутилгидропероксидом пероксидазы сохраняют 20–30% каталитической активности даже при высоких (70–80 об.%) содержаниях ИЖ в системе, при которых катализ в смесях молекулярных растворителей с водой не происходит. С использованием ПХ и ПС разработаны методики определения о-хлорфенола (сН 3–7 мкМ) и гваякола (сн 0,05–0,5 мМ) в средах вода-органический растворитель (20-25% ДМСО или ацетонитрила) и в присутствии 60-80 об.% [BMIm][BF4]. Для ферментативного определения субстратов-окислителей – трет-бутилгидропероксида и 2-бутанонпероксида с смин 0.5 и 1 нМ в нерастворимых в воде объектах (например, оливковых маслах) использован выявленный нами эффект усиления хемилюминесценции флуоресцеина в среде 75 об.% ДМСО при его окислении указанными аналитами в присутствии ПХ. Для определения антималярийных эндопероксидных соединений: природного (артемизинина) и синтетического (1,2,4,5-тетраоксана), стерически затрудненных аналогов H2O2, из изученных 5 ферментативных и 1 неферментативной индикаторных систем выбраны следующие: HCl – Н2О2 – I- и о-дианизидин - ПХ - Н2О2. Разработана методика определения 0.15–1 мМ артемизинина некаталитическим кинетическим методом, и показана возможность ферментативного определения 0.2 – 0.6 мМ 1,2,4,5-тетраоксана. Все предложенные методики успешно апробированы в анализе фармацевтических препаратов, биологических жидкостей, пищевых продуктов.
|
