ИСТИНА

В соответствии с задачами, поставленными в проекте, производились исследования, направленные на разработку различных способов ковалентного связывания фотоактивных белков с полупроводниковыми структурами при различных методах их функционализации. Исследованы свойства гибридных комплексов реакционных центров Rhodobacter sphaeroides и квантовых точек в составе различных матриц. Исследовали эффекты воздействия ультрафиолетового излучения и высокой температуры на спектры поглощения и перенос электрона гибридных конструкций РЦ и квантовых точек (КТ). Наиболее эффективной в обеспечении стабильности функциональных свойств полученных гибридных соединений была трегалоза. Было исследовано влияние ионной силы на стабильность и процессы миграции энергии в гибридном комплексе на основе полупроводниковых квантовых точек и замещенных фталоцианинов алюминия. Было показано, что электростатическое взаимодействие в гибридном комплексе КТ-ФЦ достаточно велико, поскольку увеличение ионной силы раствора не нарушает стабильность комплекса КТ-ФЦ; кроме того, наличие ионов NaCl в растворе способствует усилению эффективности миграции энергии в комплексе. Созданы ковалентно связанные гибридные структуры из полупроводниковых нанокристаллов (CdSe/ZnS-квантовые точки) с фотосинтетическим белком аллофикоцианином (АФЦ). Установлено, что квантовые точки CdSe/ZnS образуют стабильные комплексы с АФЦ в водных растворах. Показано, что эффективность переноса энергии электронного возбуждения в таких системах может быть существенно повышена при условиях, вызывающих мономеризацию тримеров аллофикоцианина. Созданные ковалентно связанные гибридные структуры открывают новые возможности для их практического применения в качестве флуоресцентных маркеров, гибридных фотосенсоров, элементов гибридных фотоэлектрических ячеек. Производились исследования коваленто-связанных гибридных систем на основе фотоактивного белка OCP и ряда флуоресцентных красителей. Ковалентное мечение ОСР красителем на основе тетраметилродамина по трем цистеинам позволило получить систему, флуоресценция которой чувствительна к фотоиндуцированному изменению конформации белка ОСР. Анализ кинетик флуоресценции фотоактивного белка при его фотоиндуцированной конформации позволил визуализировать перемещение каротиноида внутри фотоактивного белка, что дало возможность разработать метод для детектирования локальных изменений температуры и вязкости среды. Изучалось взаимодействие между ап-конверсионными наночастицами и октакарбоксифталоцианином алюминия в водных растворах. Было показано, что полученные в результате самосборки гибридные комплексы устойчивы в воде и растворах NaCl.. Показано, что при инфракрасном лазерном облучении (900 нм) в гибридном комплексе с фталоцианином генерируется синглетный кислород. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, представляют интерес с точки зрения направленного поиска компонентов для гибридных высокоэффективных фотосенсибилизаторов, биосенсоров для визуализации биологических тканей, экологических приложений и фотодинамической терапии. В ходе выполнения проекта широко использовались междисплинарные подходы с привлечением методов биофизики, биохимии, физики конденсированных сред, физики наносистем, молекулярной динамики. Результаты исследований, полученные в ходе выполнения проекта опубликованы в ведущих российских и международных научных журналах, доложены в ряде международных конференций и получили широкое международное признание. Задачи проекта полностью выполнены.

In accordance with the tasks set in the project, studies were carried out aimed at developing various ways of covalent binding of photoactive proteins with semiconductor structures under various methods of their functionalization. The properties of hybrid complexes of the reaction centers of Rhodobacter sphaeroides and quantum dots in the composition of various matrices are studied. The effects of ultraviolet radiation and high temperature on the absorption spectra and electron transport of hybrid RC and quantum dot (QD) designs were studied. Trehalose was the most effective in ensuring the stability of the functional properties of the resulting hybrid compounds. The effect of ionic strength on the stability and energy migration processes in a hybrid complex based on semiconductor quantum dots and substituted aluminum phthalocyanines was investigated. It was shown that the electrostatic interaction in the hybrid complex of QD-PC is sufficiently large, since an increase in the ionic strength of the solution does not impair the stability of the QD-PC complex. In addition, the presence of NaCl ions in the solution promotes an increase in the efficiency of energy migration in the complex. Covalently coupled hybrid structures from semiconductor nanocrystals (CdSe / ZnS quantum dots) with photosynthetic protein allophycocyanine (APC) have been created. It is established that the CdSe / ZnS quantum dots form stable complexes with AFC in aqueous solutions. It is shown that the efficiency of electronic excitation energy transfer in such systems can be substantially increased under conditions that cause the monomerization of allophicocyanine trimers. The covalently linked hybrid structures that have been created open up new possibilities for their practical application as fluorescent markers, hybrid photosensors, elements of hybrid photovoltaic cells. Studies of covalently-coupled hybrid systems based on the photoactive protein OCP and a number of fluorescent dyes were made. Covalent labeling of OCP with a tetramethyl-rhodamine dye on three cysteines made it possible to obtain a system whose fluorescence is sensitive to the photoinduced change in the conformation of the OCP protein. Analysis of the kinetics of the fluorescence of the photoactive protein during its photoinduced conformation allowed the visualization of the movement of the carotenoid inside the photoactive protein, which made it possible to develop a method for detecting local changes in temperature and viscosity of the medium. The interaction between up-conversion nanoparticles and octacarboxyphthalocyanine aluminum in aqueous solutions was studied. It was shown that the hybrid complexes obtained as a result of self-assembly are stable in water and NaCl solutions. It has been shown that infrared laser irradiation (900 nm) generates singlet oxygen in a hybrid complex with phthalocyanine. The results obtained during the project implementation are of interest from the point of view of directed search for components for hybrid highly efficient photosensitizers, biosensors for biological tissue imaging, environmental applications and photodynamic therapy. In the course of the project, interdisciplinary approaches were widely used involving biophysics, biochemistry, condensed matter physics, nanosystem physics, molecular dynamics. The research results obtained during the project implementation have been published in leading Russian and international scientific journals, were reported in a number of international conferences and received wide international recognition. Project objectives are fully met.

В рамках проекта должны быть разработаны принципы создания гибридных систем из полупроводниковых квантовых точек типа CdTe и CdSe/ZnS и различных фотосинтетических ПБК, фталоцианинов и порфиринов с целью установления оптимальных условий для высокоэффективного энергетического взаимодействия КТ с акцепторами энергии. Поскольку одним из важных условий успешной и продолжительной работы гибридных фотопреобразующих систем с включением биомакромолекул является стабильность функционирования последних, необходимо будет выполнить исследование функциональных свойств и стабильности гибридных комплексов в различных средах, например, в трегалозе, предотвращающей доступ кислорода к белкам. Для увеличения стабильности гибридных структур предполагается использовать следующие подходы: 1. Создание ковалентносвязанных комплексов донора и акцептора, например, за счет реакции этерификации (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) –СООН функциональных групп оболочки КТ и –ОН групп в структуре белка. Однако, этот подход имеет ряд существенных ограничений, поскольку расположение подходящих для сшивки аминокислотных остатков в ПБК может существенно отличаться в зависимости от типа ПБК. Кроме того, образование ковалентной сшивки может привести к изменению третичной и даже вторичной структуры ПБК и, соответственно, изменению спектральновременных характеристик комплекса по сравнению с нативной структурой. Поэтому для прочного связывания КТ с биоорганическими компонентами гибридных комплексов следует предусмотреть использование молекулярных спейсеров. 2. Подбор оптимальных условий (рН, ионная сила растворителя) для оптимизации электростатических взаимодействий молекул донора и акцептора энергии. Необходимо также обеспечить контроль за конформационным состоянием хромофоров и водно-белковой матрицы ПБК. 3. Создание пространственно-упорядоченных структур в полупроводниковых мезопористых матрицах, например из оксида титана TiO2. Такие мезопористые структуры обладают большой удельной поверхностью, в то время как размер пор соответствует размерам единичного комплекса КТ+ПБК. 4. Модификация первичной последовательности ПБК с помощью методов молекулярной биологии. Например, введение поли-гистидиновой (His-tag) последовательности на С-конце белка позволит создать локальный положительный заряд, доступный для взаимодействия с отрицательно заряженными группами функциональной оболочки КТ, а также обеспечит достаточно прочное координационное взаимодействие между гистидинами и ядром КТ. 5. Создание прочно связанных гибридных структур из полупроводниковых КТ и фталоцианинов, обладающих высокой эффективностью генерации АФК, для биомедицинских и экологических приложений. Вышеперечисленные подходы будут использованы для изучения взаимодействия ПБК и КТ в рамках проекта. ПБК являются чрезвычайно сложными структурами, фотоактивные свойства и спектрально-временные характеристики которых напрямую зависят от конформации хромофоров и белкового окружения. Поэтому представляется целесообразным развить рассматриваемые концепции с учетом комплексного исследования структурно-динамических свойств пигмент-белковых наноструктур (фотоактивных белков), а также их гибридных систем с неорганическими наносистемами. Для изучения конформационно-динамического состояния структуры ПБК и их стабильности при взаимодействии с КТ будет применен комплекс современных оптических методов, в том числе флуоресцентная спектроскопия с пикосекундным временным разрешением, позволяющая регистрировать изменения времен жизни флуоресценции как хромофорных групп, так и ароматических аминокислотных остатков в составе ПБК. Для поиска общих закономерностей образования гибридных структур в рамках проекта будут использованы модельные объекты – ПБК, обладающие высокой структурной стабильностью, а также водорастворимые поликатионные фталоцианины цинка и алюминия. Важно отметить, что оба класса акцепторов способны к фотосенсибилизированной генерации активных форм кислорода, что позволяет использовать это явление для изучения эффективности процессов светосбора и переноса энергии от искусственных антенных комплексов к акцепторам энергии. В результате данные исследования позволят получить ответ на вопрос о принципиальной возможности создания стабильных гибридных систем типа квантовая точка – акцептор белковой или органической природы, способных эффективно поглощать свет в спектральных областях, где поглощение этих свободных акцепторов крайне мало. Для осуществления данной общей цели поставлены следующие задачи: 1. Изучить спектральные характеристики и процессы миграции энергии в гибридных комплексах типа КТ – акцептор белковой или органической природы. Определить структуру гибридного комплекса, расстояние между донором и акцептором энергии, эффективность миграции энергии и коэффициент усиления флуоресценции акцептора. Оценить устойчивость полученных гибридных структур к фотодеградации. 2. Используя ряд модельных систем и соответствующих методик, исследовать влияние квантовых точек на скорость образования продуктов фотохимической реакции. Выполнить необходимые теоретические расчеты, позволяющие оптимизировать донорноакцепторные взаимодействия в созданных гибридных комплексах. 3. Оценить нативность конформации ПБК в сконструированных гибридных структурах, а также устойчивость комплексов к изменению температуры. Исследовать стабильность комплексов в различных матрицах, включая их в стекловидные среды типа трегалозы, стабилизирующие биоструктуры и препятствующие доступу кислорода. Известно, что спектральные характеристики квантовых точек зависят от размера ядра нанокристалла. Поэтому из одного материала (например CdSe или CdTe) можно изготовить целый ряд спектрально различных квантовых точек, отличающихся положением максимума флуоресценции. Одним из важных параметров, определяющим эффективность миграции энергии в гибридной системе, является интеграл перекрывания спектра флуоресценции донора (квантовая точка) и акцептора энергии. Например, для пары КТ+фталоцианин наибольшие значения интегралов перекрывания спектров будут наблюдаться в гибридных структурах из квантовых точек с максимумом эмиссии 660-680 нм. В случае КТ+ПБК спектр фотолюминесценции КТ должен хорошо перекрываться со спектром поглощения фотоактивного компонента РЦ. Именно такие системы представляют наибольший интерес с точки зрения выхода продуктов фотохимической реакции. Однако, в таких системах также будет наблюдаться частичное перекрывание спектров флуоресценции КТ и акцепторов энергии, что значительно затрудняет изучение процессов миграции энергии и определение эффективности фотохимической реакции спектральными методами. Поэтому важной составляющей проекта будет являться разработка методик корректной оценки выхода продуктов фотохимической реакции (выход АФК, спектральная эффективность реакции разделения зарядов в РЦ).

В ходе работ по проекту была показана возможность создания ковалентно связанных гибридных структур из CdSe/ZnS (КТ620) и аллофикоцианина (АФЦ), белка из ССК цианобактерий. Для успешного ковалентного связывания аллофикоцианина с КТ была разработана методика перевода данного пигмент-белкового комплекса в из тримерной в мономерную форму, что является важнейшим результатом исследований. Использование полупроводниковых нанокристаллов (КТ) в качестве неорганической фокусирующей антенны позволлило усиливать флуоресценцию и фотосенсибилизирующую активность поликатионных фталоцианинов алюминия (ФЦ). При возбуждении данных гибридных комплексов интенсивность флуоресценции ФЦ и скорость фотосенсибилизированной ФЦ генерации синглетного кислорода многократно увеличивается (до 500% и 350% соответственно) по сравнению со свободным ФЦ той же концентрации. Данный результат открывает широкие возможности по разработке эффективных методов фотодинамической терапии онкологических заболеваний, очень актуальных в настоящее время. Работы по созданию гибридных конструкций на основе фотоактивного белка OCP и ряда флуоресцентных красителей, ковалентное мечение ОСР флуоресцентным красителем на основе тетраметилродамина по трем цистеинам позволили получить систему, флуоресценция которой чувствительна к фотоиндуцированному изменению конформации ОСР. Анализ данных изменений позволил визуализировать перемещение каротиноида внутри белка и разработать метод для детектирования локальных изменений температуры и вязкости среды. Данные исследования были проведены на передовом научном уровне, в результате кооперации с ведущими научными группами России и Германии.

В соответствии с задачами, поставленными в проекте, производились исследования, направленные на разработку различных способов ковалентного связывания фотоактивных белков с полупроводниковыми структурами при различных методах их функционализации. Исследованы свойства гибридных комплексов реакционных центров Rhodobacter sphaeroides и квантовых точек в составе различных матриц. Исследовали эффекты воздействия ультрафиолетового излучения и высокой температуры на спектры поглощения и перенос электрона гибридных конструкций РЦ и квантовых точек (КТ). Наиболее эффективной в обеспечении стабильности функциональных свойств полученных гибридных соединений была трегалоза. Было исследовано влияние ионной силы на стабильность и процессы миграции энергии в гибридном комплексе на основе полупроводниковых квантовых точек и замещенных фталоцианинов алюминия. Было показано, что электростатическое взаимодействие в гибридном комплексе КТ-ФЦ достаточно велико, поскольку увеличение ионной силы раствора не нарушает стабильность комплекса КТ-ФЦ; кроме того, наличие ионов NaCl в растворе способствует усилению эффективности миграции энергии в комплексе. Созданы ковалентно связанные гибридные структуры из полупроводниковых нанокристаллов (CdSe/ZnS-квантовые точки) с фотосинтетическим белком аллофикоцианином (АФЦ). Установлено, что квантовые точки CdSe/ZnS образуют стабильные комплексы с АФЦ в водных растворах. Показано, что эффективность переноса энергии электронного возбуждения в таких системах может быть существенно повышена при условиях, вызывающих мономеризацию тримеров аллофикоцианина. Созданные ковалентно связанные гибридные структуры открывают новые возможности для их практического применения в качестве флуоресцентных маркеров, гибридных фотосенсоров, элементов гибридных фотоэлектрических ячеек. Производились исследования коваленто-связанных гибридных систем на основе фотоактивного белка OCP и ряда флуоресцентных красителей. Ковалентное мечение ОСР красителем на основе тетраметилродамина по трем цистеинам позволило получить систему, флуоресценция которой чувствительна к фотоиндуцированному изменению конформации белка ОСР. Анализ кинетик флуоресценции фотоактивного белка при его фотоиндуцированной конформации позволил визуализировать перемещение каротиноида внутри фотоактивного белка, что дало возможность разработать метод для детектирования локальных изменений температуры и вязкости среды. Изучалось взаимодействие между ап-конверсионными наночастицами и октакарбоксифталоцианином алюминия в водных растворах. Было показано, что полученные в результате самосборки гибридные комплексы устойчивы в воде и растворах NaCl.. Показано, что при инфракрасном лазерном облучении (900 нм) в гибридном комплексе с фталоцианином генерируется синглетный кислород. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, представляют интерес с точки зрения направленного поиска компонентов для гибридных высокоэффективных фотосенсибилизаторов, биосенсоров для визуализации биологических тканей, экологических приложений и фотодинамической терапии. В ходе выполнения проекта широко использовались междисплинарные подходы с привлечением методов биофизики, биохимии, физики конденсированных сред, физики наносистем, молекулярной динамики. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, показывают, что исследования в ходе проекта проводились на передовом научном уровне. Результаты проекта опубликованы в ведущих отечественных и высокорейтинговых зарубежных научных журналах, доложены на ведущих отечественных и международных научных конференциях и вызвали широкий интерес в международной научной общественности. Задачи проекта полностью выполнены.