![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
На основе новых оригинальных приемов разработаны флуоресцентные индикаторные системы для экспресс-определения антиоксидантов - флавоноидов, как в растворе, так и в твердофазном варианте. Один из приемов заключается в получении интенсивно флуоресцирующих производных флавоноидов в результате взаимодействия продуктов их пероксидазного окисления с ароматическим амином - 1,2-дифенилэтилендиамином (ДЭД). Предложенный прием позволяет определять флавоноиды на микромолярном уровне концентраций и одновременно за 15-30 мин анализировать до 20 образцов проб в ячейках полистирольного планшета с иммобилизованной в прозрачной пленке хитозана пероксидазой. При использовании вместо пероксидазы ее миметика - комплекса железа(III) с тетрамидомакроциклическим лигандом (ТАМЛ) образуется такой же продукт дериватизации флавоноидов, что и в присутствии пероксидазы, однако чувствительность методик определения флавоноидов ниже. Предложенные индикаторные системы могут быть использованы для экспрессного, высокочувствительного, селективного и воспроизводимого определения кверцетина, эпикатехина, кофейной кислоты и таксифолина в диапазонах концентраций 0.1-5, 1-10, 0.1-10, 0.5-5 мкM соответственно. Те же системы можно применять для флуориметрического детектирования флавоноидов после их разделения методом ВЭЖХ в диапазонах концентраций 0.16 - 2.5, 0.17 - 2.6, 0.06 – 4.2 мкM соответственно, а также хроматографически анализировать объекты с неизвестным заранее сочетанием флавоноидов. Разработанные методики успешно применены для анализа различных фармацевтических препаратов, содержащих флавоноиды, и для анализа растительного сырья. Реакции дериватизации продуктов ферментативного окисления флавоноидов - кофейной кислоты и эпикатехина с ДЭД в присутствии пероксидазы либо ее миметика – комплекса Fe(III) с ТАМЛ использованы для определения 5-100 мкМ окислителей продукта дериватизации - неорганического и органических пероксидов в целях экспресс-диагностики окислительного стресса по их содержанию в крови. Другой перспективной системой для определения пероксидов водорода, мочевины и кумола, 2-бутанонпероксида, трет-бутилгидропероксида (ПО 2 - 250 мкМ) оказалась реакция образования флуоресцирующего комплекса Eu(III)-тетрациклин, интенсивность флуоресценции которого возрастает при присоединении к нему пероксида. Эта реакция изучена не только в водной среде, но и в присутствии органических растворителей - ацетона, этанола, ацетонитрила, ДМСО, а также ПАВ - ТВИН 80, ТРИТОН Х-100, ДДС и ЦТАБ. Выяснено, что гидропероксиды целесообразно определять только в среде ацетона. Предложенные флуоресцентные индикаторные системы для определения гидропероксидов апробированы в анализе биологических объектов (плазме крови мышей и в клетках аденокарциномы толстой кишки человека). Для одновременного мультиплексного высокоселективного определения катехоламинов (допамина, адреналина, норадреналина) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) впервые использовано сочетание дериватизации продуктов их ферментативного окисления одновременно с двумя различными ароматическими аминами - бензиламином (БА) и 1,2-дифенилэтилендиамином (ДЭД) с обработкой спектров (для повышения их разрешения) образующихся интенсивно флуоресцирующих производных методами производной флуориметрии первого и второго порядков. Флуоресценцию измеряли в 96-луночном планшете, в ячейках которого помещен биочувствительный полимерный слой хитозана с иммобилизованной пероксидазой. Мультиплексное определение катехоламинов и их метаболитов одновременно из одной пробы достигается за счет направленного регулирования длин волн возбуждения и испускания (в интервалах 300 - 356 и 425 – 480 нм, соответственно). Разработанные сенсорные системы и методики на их основе, адаптированные под серийное оборудование, обеспечивают высокочувствительное (в диапазоне концентраций 3–200 нM), селективное и воспроизводимое (Sr ≤ 0.01, n = 5) определение катехоламинов и их метаболитов. Они успешно применены для экспрессного анализа (20 образцов за 15–30 мин) мочи человека и плазмы крови мышей. Методики позволяют селективно определять одни катехоламины на фоне других, что позволяет применять их для экспресс-диагностики таких катехоламин-продуцирующих заболеваний, как карциноид, феохромоцитома и нейробластома.